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Clonage et expression de la protéine CFP10 de Mycobactérium Tuberculosis dans Pichia Pastoris

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par Bilel Masmoudi
INSAT - Ingénieur 2006
  

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III.2) Les vecteurs et cassettes d'expression :

Pour la production des protéines recombinantes, les vecteurs ainsi que les cassettes d'expression jouent un rôle primordial dans l'amélioration de la qualité et la quantité de la protéine d'intérêt.

En ce qui concerne les cassettes d'expression, elles consistent en une organisation de différentes séquences intervenant non seulement dans la régulation et le contrôle de l'expression des gènes, mais aussi dans le maintien et la stabilité du vecteur.

Dans le cas de la levure on distingue essentiellement 4 types de vecteurs qui différent par le mécanisme de leur maintien :

YIP (Yeast Integrating Plasmid) : ce sont des vecteurs auxquels il manque l'origine de réplication dans la levure, donc qui doivent se propager comme un élément intégratif dans le chromosome de la levure et le plus souvent dans une seule copie par génome.

YRP (Yeast Replicatif Plasmid) : ce sont des vecteurs qui présentent une séquence de réplication autonome (ARS), ce sont des plasmides instables et à réplication autonome.

YCP (Yeast Centromer Plasmid) : ces vecteurs présentent une origine de réplication et une séquence centromérique, ce sont des plasmides stables et qui se propagent en un faible nombre de copies.

YEP (Yeast Episomal Plasmid) : ces vecteurs présentent un fragment de plasmide de levure de 2um, ils se propagent en un grand nombre de copies et ils ont une réplication autonome et une ségrégation irrégulière.

Il est possible de diriger l'intégration du vecteur ou du moins une partie dans un site spécifique dans le génome de la levure, où il peut se répliquer d'une façon stable et se maintient comme une partie du chromosome de l'hôte.

Vu que ces plasmides peuvent s'amplifier et s'isoler facilement à partir d' E.coli, chacun de ces vecteurs est désigné comme un vecteur navette qui inclut des séquences permettant la sélection et le maintien du plasmide dans les deux systèmes hôtes, des séquences qui permettent la transcription et la traduction efficace du gène étranger, des séquences qui permettent une bonne terminaison de la transcription et la présence d'un promoteur constitutif et régulable. (12).

IV) Le système d'expression Pichia pastoris :

IV.1) Principaux avantages du système :

Depuis 1980, la société américaine Phillips Petroleum a créé une filiale, la société SIBIA (Salk Institut Biotechnology Industrial Associates), qui se consacre au développement et l'exploitation de Pichia pastoris.

SIBIA a breveté cette levure, et a produit comme essai, l'antigène HBs : son expression intracellulaire est impressionnante. Les taux obtenus sont 5 à 100 fois plus élevés que S.cerevisiae.

La société a également annoncé quelle avait obtenue 6 à 10 g de TNF purifié par litre de culture.

Lorsque les protéines hétérologues sont secrétées, les taux obtenues sont plus faible mais ils restent extrêmement intéressants : l'antigène HBs a été produit à raison de 2 g/l, l'invertase 2,3g/l et un taux qui dépasse 1g/l pour la sérum albumine humaine.

Plusieurs avantages sont offerts suite à l'utilisation de pichia pastoris parmi ces avantages on peut citer :

· La facilité de manipulation.

· Taux d'expression important (10 à 100 fois plus élevé que S.cerevisiea ).

· Pichia pastoris offre un choix d'expression de la protéine recombinante sous forme intracellulaire ou secrétée. (5) ; (7).

· Capacité d'effectuer plusieurs modifications post-traductionnelles : formation de ponts disulfure, phosphorylation, acylation, avec un repliement correct des protéines. (19).

· Etant méthylotrophiques, Pichia pastoris possède la faculté d'assimiler le méthanol comme une seule source de carbone et d'énergie, en effet cette levure possède une voie d'utilisation de méthanol hautement inductible, elle est capable de convertir 30 à 40% de son poids en protéines, ces protéines qui sont synthétisées lorsque la levure pousse sur le méthanol sont indétectable lorsque la levure pousse sur le glucose ou le glycérol. (22).

· Les problèmes d'hyperglycosylation observés chez S.cerevisiea sont beaucoup moins importants pour Pichia pastoris.

· La stabilité de la cassette d'expression dans le génome de la levure, sa capacité de sécrétion, les faibles taux de protéines contaminants dans le milieu de culture et la rapidité de croissance de la levure sur des milieux non coûteux et dans les fermenteurs font de Pichia patoris un système de choix pour l'expression de protéines hétérologues. (8).

Vu ces caractéristiques intéressantes : certaines protéines (exemple la protéine G) qui n'ont pas étaient sécrétées d'une manière efficace chez les bactéries ou chez saccharomyces cerevisiae ou dans les cellules d'insectes ont était obtenues avec succès dans Pichia pastoris. (9) ; (19).

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