IV.2) Le métabolisme du
méthanol :
Etant méthylotrophiques,
Pichia pastoris possède la faculté d'assimiler le
méthanol comme une seule source de carbone, en effet, la première
étape du métabolisme consiste en une oxydation du méthanol
en formaldéhyde en présence de l'alcool oxydase.
Cette enzyme étant faiblement affine à
l'oxygène, se trouve produite en grande quantité.
Deux gènes distincts(AOX1 et AOX2) codent pour l'alcool
oxydase, le gène AOX1 est plus fortement induit par le méthanol
que le gène AOX2 et se trouve donc majoritairement responsable de
l'activité de l'enzyme dans la cellule.
L'expression de l'AOX1 se fait selon le mécanisme de
répression induction. En effet, la présence de n'importe quelle
source de carbone autre que le méthanol empêche l'expression du
gène, cependant, l'absence de cette source n'implique pas son
expression. Ainsi le gène AOX1 a été isolé, son
promoteur a été introduit dans des vecteurs pour diriger
l'expression du gène codant pour la protéine
désirée. (7).
V) Stratégie d'expression chez Pichia
pastoris :
V.1) Les vecteurs d'expression :
Les vecteurs d'expression construits
sont des YIP capables de se maintenir et de se propager dans les deux
systèmes hôtes E.coli et Pichia pastoris. Par
exemple des vecteurs utilisés pour l'expression des protéines
recombinantes dans P.pastoris on peut citer les vecteurs de la famille
pPICZ (figure1) qui comprennent :
- une séquence promotrice et terminatrice du
gène AOX1, séparées par plusieurs sites de restriction qui
servent à insérer la séquence à exprimer et par
deux séquences codant pour le myc epitope et un queue polyhistidine
(his6).
- un gène de résistance à la
zéocine et un gène HIS4 pour la sélection des souches
recombinantes.
- une origine de réplication chez E.coli.
Le vecteur peut inclure également une séquence
signal de sécrétion en amont de la séquence
d'intérêt pour obtenir une protéine
sécrétée.
Figure1 : La famille des vecteurs pPICZ
| 
