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L'amélioration génétique du cacaoyer. Des ressources génétiques forestières aux variétés cultivées

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par Philippe LACHENAUD
Université Montpellier II - Habilitation à  diriger des recherches 2010
  

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E) Tests à Montpellier (Cirad)

Parmi les clones qui se révèleront "Très résistants" ou "Résistants" au P. palmivora et à M. perniciosa en Guyane, certains seront expédiés à Montpellier pour y être testés contre P. megakarya (et également, contre des souches très agressives de M. perniciosa).

Les baguettes des clones retenus seront expédiées à Montpellier dès la conclusion des tests en Guyane. Dix plants de chaque clone seront nécessaires (5 pour les tests M. perniciosa et 5 pour les tests-feuille vis-à-vis de P. megakarya). Des semences seront donc expédiées de Guyane six mois auparavant, afin de disposer en temps voulu de porte-greffes au bon stade. Les baguettes des clones seront expédiées en deux fois, à 2 mois d'intervalle, en juin et août de l'année 2. Les tests à Montpellier commenceront lorsque les plants greffés auront 6 mois.

F) Prélèvements des endophytes

Les souches endophytes des champignons Trichoderma sont capables de former des associations endophytes dans les troncs des arbres. Certains de ces endophytes montrent un bon potentiel pour le contrôle des maladies du cacaoyer (Evans et al., 2003 ; Holmes et al., 2004 ; Crozier et al. , 2006 ; Samuels et al., 2006 ).

Les cultures de Trichoderma et/ou autres seront obtenues à partir de deux sources : les endophytes des troncs et des feuilles de cacao (et d'autres espèces ligneuses), d'une part, et les endophytes issus du sol, d'autre part.

- Collecte d'endophytes des troncs

La diversité des champignons endophytes sera étudiée dans des populations naturelles de cacaoyers. Les prospecteurs rechercheront des cacaoyers sauvages et y échantillonneront les endophytes des feuilles et des troncs. On recherchera en particulier des cacaoyers apparemment résistant à la maladie du balai-de-sorcière.

Echantiionnage

Le nombre d'arbres à échantillonner dépendra du nombre de cacaoyers sauvages trouvés et sera donc déterminé au moment de la prospection, l'objectif étant d'échantillonner au moins 6 arbres sur chaque site. Les données GPS de chaque arbre seront enregistrées.

Des échantillons issus de cacaoyers introduits (collection de Paracou-Combi) et de la végétation dominante environnante seront également récoltés, afin de comparer les différentes espèces d'endophytes.

Isolement

On suivra le protocole d' Evans et al (2003).

Une surface d'écorce d'environ 8 x 6 cm sera prélevée sur chaque tronc à hauteur d'épaule (1,5 m) à l'aide d'une machette désinfectée (alcool + flamme). La partie exposée sera nettoyée avec un scalpel (lame n° 22) et la couche sous-jacente avec une lame n° 10a. Dix tranches triangulaires d'aubier (0,8 x 0,5 cm) seront prélevées et transférées individuellement (avec des pinces stériles) dans des boîtes de Petri (3 cm de diamètre) contenant deux types de milieux : 5 à base de 20 % de PDA (Potato Dextrose Agar) et d'une solution de 10 mg/l de pénicilline-streptomycine, et 5 de MEA (Malt Extract Agar) + chloramphenicol (0,05 g/l). Les boîtes de Petri seront scellées avec du ruban adhésif et conservées en boîtes plastiques. Les fenêtres ouvertes dans les troncs seront obturées immédiatement avec un mastic horticole pour blessures. Tous les instruments seront désinfectés à l'alcool (+ flamme). Les boîtes de Petri seront envoyées au laboratoire de l'USDA à Beltsville (USA) avec un permis APHIS (Animal and Plant Health Inspection Service).

Les cultures seront examinées pendant une période de 8 semaines, en incubation à 25°C. Du mycélium et des spores seront isolés dès leur apparition.

- Collecte d'endophytes des feuilles Echantiionnage

Sur les mêmes arbres, on prélèvera des feuilles. De même, des échantillons de feuilles issus de la végétation dominante seront également récoltés, ainsi que des cacaoyers introduits, afin de comparer les différentes espèces d'endophytes.

Isolement

Six feuilles seront récoltées sur chaque arbre. Les feuilles seront celles de la dernière poussée foliaire et devront être exemptes de dommages d'insectes ou de traces de maladies. 16 segments de la lamelle moyenne de chaque feuille (2 mm2 chacun) seront prélevés, à égale distance de la nervure médiane et de la bordure, et stérilisés dans des

tubes Sterlin de 8 ml contenant une solution d'hypochlorite de sodium (à 5 %) pendant 5 mn. Ensuite, les segments seront rincés successivement dans 3 tubes Sterlin contenant de l'eau distillée stérile. Les segments seront ensuite transférés (avec des pinces stérilisées à l'alcool) dans des boîtes de Petri contenant de l'agar (comme dans le cas des échantillons de troncs). L'isolement sera réalisé autant que possible dans les 4 heures suivant la collecte des feuilles, avec une cellule portable.

- Echantillonnage des Trichoderma des sols.

Des Trichoderma seront isolés du sol autour des arbres sélectionnés, ce qui donnera une indication possible de l'origine des endophytes des troncs. Au maximum 5 échantillons de sols seront collectés dans un rayon de deux mètres autour du tronc de chaque cacaoyer échantillonné. Les Trichoderma peuvent être isolés à l'aide d'un milieu spécifique sélectionné (Papavizas & Lumsden 1982). Des échantillons de quelques grammes de sol seront prélevés sous la litière, stockés dans des sacs en papier et isolés jusqu'au retour au laboratoire.

- Essais in vitro du potentiel de contrôle microbien

Une évaluation in vitro du mycoparasitisme et de la production d'antibiotiques des cultures sera réalisée, si nécessaire. Une des hypothèses à tester est que le genre Trichoderma offre le meilleur potentiel de contrôle microbien parce qu'il ne comprend pas de pathogène de la plante et parce qu'il a déjà été montré que des Trichoderma sont efficaces dans le contrôle des maladies pour beaucoup de cultures.

Aucun essai in vitro n'est fiable à 100%, mais il est essentiel d'avoir une méthode d'estimation du potentiel du contrôle microbien. Pour les essais sur le mycoparasitisme potentiel des espèces de Moniliophthora, ce projet utilisera le test de pré-inoculation modifié comme décrit par Evans et al (2003).

Une boîte de Petri (9 cm) est inoculée d'un côté avec le pathogène-cible. Le pathogène se développe et remplit la boîte ; une bande d'agar (env 15 x 3 mm) contenant le mycopathogène proposé est déposée au côté opposé, puis la boîte est mise à incuber (une semaine à 25 °C). Des prélèvements dans l'agar (de 3 mm de diamètre) sont effectués le long d'une ligne allant du point d'inoculation du pathogène à celui de l'antagoniste. Les divers prélèvements sont placés séparément dans des boîtes de Petri contenant du milieu PDA 20% et incubées à 25°C. Les boîtes sont ensuite examinées pour déterminer à quelle distance (du point de prélèvement au point d'inoculation du myco-pathogène) on peut retrouver le myco-pathogène.

Cette procédure est répétée chaque semaine pendant trois semaines. Le fait de retrouver le myco-pathogène testé dans tous les prélèvements indique un mycoparasitisme efficace.

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