WOW !! MUCH LOVE ! SO WORLD PEACE !
Fond bitcoin pour l'amélioration du site: 1memzGeKS7CB3ECNkzSn2qHwxU6NZoJ8o
  Dogecoin (tips/pourboires): DCLoo9Dd4qECqpMLurdgGnaoqbftj16Nvp


Home | Publier un mémoire | Une page au hasard

 > 

Validation de procédé de production d'antigène viral sur culture cellulaire BHK21

( Télécharger le fichier original )
par Ghaith Ben Messaoud
Institut supérieur des technologies médicales de Tunis - Licence appliquée en biotechnologies médicales 2013
  

précédent sommaire suivant

Bitcoin is a swarm of cyber hornets serving the goddess of wisdom, feeding on the fire of truth, exponentially growing ever smarter, faster, and stronger behind a wall of encrypted energy

V. Inoculation du virus M33

L'inoculation virale en culture cellulaire a pour but la multiplication du virus et la production d'HA.

Le tube contenant la suspension virale M33 est décongelé et le milieu DMEM 5% SVF est éliminé des bouteilles Roller. L'étape qui suit est l'inoculation. Dans chaque bouteille Roller 1 ml de la suspension virale est mis, soit environ 1 virus pour 2 cellules (On compte 200 millions de cellules par bouteille Roller. 1 ml de semence virale a un titre de 108 virus). 30 ml du milieu DMEM 2% SVF sont ajoutés dans la bouteille Roller.

Figure 23: Inoculation du virus

Après une heure d'incubation à température ambiante les bouteilles sont mises dans l'appareil Roller à 37°C avec une rotation continue pour une durée de 7h. Enfin, un rinçage avec le milieu DMEM 0% SVF est effectué et un nouveau milieu DMEM 0% est ajouté et l'incubation se poursuit pour une durée de 3 jours à 37°C dans le milieu DMEM 0% SVF.

Le procédé de passage cellulaire et inoculation du virus est résumé comme suit:

1 flasque 25 cm 2 1 flasques 75 cm2 2 flasques 150cm2

4 flasques 225cm2 4 bouteilles Roller Inoculation virale

ISTMT-IPT 2012-2013

31

ISTMT-IPT 2012-2013

32

V.1. Récolte

Après 3 jours d'incubation vient l'étape de la récolte. Le surnageant dans chaque bouteille Roller est récupéré dans un flacon de 500ml. Puis nous avons ajouté à ce surnageant le Chlorure de sodium (NaCl) 2,2g% et le Polyéthylène glycol (PEG 6000) 6g%. Après homogénéisation par agitation. Le précipité a été mis sous agitation à +4°C.

V.2. Extraction de l'HA rubéolique

Après 48h sous agitation à +4°C nous avons procédé à une centrifugation à 4°C à 3000 tours/min pendant une heure. Par la suite le surnageant est éliminé et le culot est resuspendu dans le Tampon Glycine de pH 10 (annexe 3) (soit environ 1 ml/bouteille Roller), ensuite la solution Tween 80 à 1,25% est ajouté au culot (annexe 3) (soit 1 volume de Tween 80 est ajouté a 9 volume d'HA). Ce mélange est incubé à 4°C pour une durée de 3 à 5 min.

La solution de Di-éthyle Ether (5 volume de Di-éthyle Ether) est ajoutée sous agitation à +4°C pendant 15 min. Le mélange, est par la suite centrifugé à +4°C pendant 15 min à 3000 tours/min. La phase aqueuse ainsi obtenue, est récupérée et conservée à -20°C.

C'est le lot d'HA rubéolique (1/2013).

Figure 24: Lot d'hémagglutinine

V.3. Titrage de l'HA rubéolique par la technique d'hémagglutination

Après la production de l'HA rubéolique vient l'étape du titrage.

Le titrage de l'HA se fait par la technique d'hémagglutination.

L'hémagglutination est la capacité de l'antigène (Ag) viral à agglutiner les globules rouges (GR).

Pour effectuer le test d'hémagglutination il faut:

? GR de pigeon; fournis par le service de Microbiologie Vétérinaire de L'institut Pasteur de Tunis.

· Tampon Tacetal (annexe 4) préparé et utilisé pour effectuer les différentes dilutions.

· Tampon GGB (annexe 4) préparé et utilisé pour le lavage des GR du pigeon.

· Ag rubéolique (Lot de l'HA rubéolique 1/2013).

V.3.1. Etape de titrage de l'HA

Trois lavages des GR avec le Tampon GGB sont faits.

Les GR 0,25% sont mélangés avec le Tampon Tacetal.

Dans une plaque de microtitration, la répartition des solutions est comme suit:

· 75 ul de Tampon Tacetal ont été mise dans la 1ère cupule.

· Dans les autres cupules 25 ul de Tampon Tacetal sont ajoutés.

· Dans la 1ère cupule nous avons mis 25 ul de l'HA rubéolique.

· Le contenu de la 1ère cupule est mélangé. 25ul de la solution (Tampon Tacetal +HA) sont passés à la 2ème cupule.

Cette procédure est effectuée de la même manière dans les 7 autres cupules, sauf dans la dernière (témoin négatif).

Enfin 25 ul de GR dans toutes les cupules sont ajoutés.

? Homogénéiser sur une brique de glace à +4°C et laisser une heure à température ambiante à l'abri des vibrations et chocs pour faire la lecture de la plaque.

Figure 25: Titrage de l'hémagglutinine rubéolique

précédent sommaire suivant






Bitcoin is a swarm of cyber hornets serving the goddess of wisdom, feeding on the fire of truth, exponentially growing ever smarter, faster, and stronger behind a wall of encrypted energy








"L'imagination est plus importante que le savoir"   Albert Einstein