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Validation de procédé de production d'antigène viral sur culture cellulaire BHK21

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par Ghaith Ben Messaoud
Institut supérieur des technologies médicales de Tunis - Licence appliquée en biotechnologies médicales 2013
  

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ISTMT-IPT 2012-2013

33

VI. Validation du procédé de production de l'HA rubéolique par le test ELISA indirect type IgG

VI.1. Matériel biologique

? Sérums humains

Des sérums (titrés) IgG négatifs, fortement positifs et moyennement positifs des malades sont utilisés pour la validation de l'HA rubéolique déjà préparée.

Ces sérums qui ont été fournis par le service de Virologie Clinique de L'institut Pasteur de Tunis sont titrés et conservés à -20°C.

? L'HA rubéolique (Ag)

L'HA rubéolique du lot (1/2013) est utilisé dans le test ELISA. Le rôle de l'HA est la sensibilisation de la plaque ELISA.

VI.2. Principe et étapes du test ELISA

VI.2.1. Principe

Le test ELISA indirect IgG pour la détection des anticorps anti rubéoliques de type IgG est une technique immuno-enzymatique. Ce test permet la visualisation du complexe immun (Ac-Ag) grâce à une réaction colorée produite par le Substrat chromogène Ortho-Phénylène-Diamine(OPD) préalablement fixé sur le Conjugué anti IgG marqué par la peroxydase.

ISTMT-IPT 2012-2013

Substrat

chromogène OPD

Conjugué anti IgG humain marqué à la peroxydase

IgG anti rubéolique

Hémagglutinine rubéolique

34

Principe du test ELISA indirect

VI.2.2. Réalisation du test ELISA indirect type IgG

Les étapes du test ELISA indirect sont résumées comme suit:

? Sensibilité de la plaque (coating de l'Ag)

L'étape de sensibilisation consiste à mettre dans chaque cupule de la plaque 100 ul d'HA rubéolique (lot 1/2013) dilué au 1/50ème et1/100ème dans le Tampon Carbonate/Bicarbonate (0,1M, pH=9,6) (annexe 5).

Cette étape nécessite un temps d'incubation d'une heure à 37°C ou une nuit à +4°C.

ISTMT-IPT 2012-2013

? Lavage

Après l'étape de sensibilité trois lavages par le Tampon PBS-Tween (annexe 5) ont été effectués pour éliminer l'Ag non fixé.

 
 

Figure 26: Lavage par le Tampon PBS Tween de la plaque ELISA

? Saturation de la plaque

200 ul de Tampon de saturation PBS-Tween-Gélatine 5% (annexe 5) ont été mises dans chaque cupule de la plaque ELISA une heure à 37°C pour occuper les sites qui sont restés vides après l'étape de la sensibilisation.

Cette étape est importante pour éviter les résultats faux positifs.

? Lavage

Trois lavages successifs par le Tampon PBS-Tween ont été effectués une deuxième fois pour éliminer les particules non fixés.

? Incubation du sérum

Les sérums à tester ont été dilués au 1/50éme et au 1/100éme dans le Tampon PBS-Tween-Gélatine 5% et repartis à raison de 100 ul dans chaque cupule de la plaque d'ELISA pour une durée d'incubation d'une heure a 37°C.

 
 

Figure 27: Incubation du sérum des malades

 

? Lavage

35

Cette étape comporte six lavages successifs par le Tampon PBS-Tween pour éliminer les Ac non fixés à l'Ag rubéolique.

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? Incubation du Conjugué

Le Conjugué anti IgG humain couplé à l'enzyme peroxydase (annexe 5) a été dilué à 1/10000 dans le Tampon PBS-Tween-Gélatine 5% et repartis à raison de 100 ul dans chaque cupule pour une durée d'incubation d'une heure à 37°C.

? Lavage

Chaque cupule de la plaque est lavée six fois par le Tampon PBS-Tween pour éliminer le Conjugué anti IgG humain non fixé.

? Incubation du Substrat chromogène OPD (Orto-Phénylène Diamine)

(annexe 5)

Le Substrat chromogène OPD est mis à raison de 100 ul par cupule pour une durée d'incubation de 30 min à température ambiante à l'obscurité pour le bon déroulement de la réaction de la dégradation du Substrat et l'apparition de la couleur orangée (il faut recouvrir la plaque ELISA par du papier aluminium).

? Arrêt de la réaction

Après les 30 min d'incubation la réaction enzymatique doit être arrêtée par l'ajout de 50 ul d'acide sulfurique H2SO4 4N (annexe5) dans chaque cupule.

? Lecture de la plaque par spectrophotomètre

La lecture de la plaque ELISA se fait grâce au spectrophotomètre lecteur de plaque ELISA à une longueur d'onde comprise entre 492 et 620 nm.

? Le test ELISA indirect est utilisé pour la validation de l'HA rubéolique produite. C'est un test de routine qui se base sur la révélation des anticorps IgG dans les sérums grâce à l'HA préparé au Laboratoire d'Immunotechnologie et Réactifs Biologiques (LIRB).

0

00

37

ISTMT-IPT 2012-2013

La culture en masse des cellules BHK21 a permis de produire l'HA rubéolique. Chaque passage cellulaire nécessite un temps d'incubation de 48h.

Les différents passages de la culture cellulaire et la production d'HA sont décrites comme suit:

1 flasque 25 cm 2 1 flasques 75 cm2 2 flasques 150cm2

4 flasques 225cm2 4 bouteilles Roller Inoculation virale

Production d'HA

Pour le titrage de l'Ag, l'agglutination des GR par l'HA est révélée par la présence d'une voile tapissant au fond de la cupule (agglutinats visibles à l'oeil nu).

Tableau 1: Résultats de titrage de l'HA

Cupules

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Dilutions

1/4

1/8

1/16

1/32

1/64

1/128

1/256

1/512

1/1024

Témoin négatif

Réactifs

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

(ul):

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

-Tacetal

75

25

 

25

25

25

25

25

25

25

 

25

-Antigène

25

---

 

---

 

---

 

---

---

---

---

---

 

---

-Dilution

 

25

 

25

 

25

 

25

25

25

25

25

 

-Globules rouges

25

25

25

25

25

25

25

25

25

25

 

Résultats

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

? Le titre de l'hémagglutinine rubéolique est compris entre 512 et 1024 unité hémagglutinante (UHA).

·

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Ce test est fait 2 fois, avec toujours les même résultats.

· Ce titre est considéré, élevé.

Dans le test ELISA indirect IgG 6 sérums ont été utilisés pour contrôler l'efficacité et la spécificité du lot d'HA produit par la technique de culture cellulaire :

· 2 sérums négatifs

· 2 sérums moyennement positifs de titre 13 et 10 UI/ml

· 2 sérums fortement positifs de titre 237 et 228 UI/ml

Ces sérums vont nous servir aussi pour connaitre dans le stade de préparation du Kit ELISA et la dilution adéquate d'HA à utiliser pour l'étape de la sensibilisation de la plaque ELISA.

Les résultats des différentes combinaisons testées sont présentés dans les tableaux suivants: Tableau 2: Test numéro 1

· Dilution de l'HA = 1/50

· Dilution du sérum = 1/50

· Dilution du Conjugué = 1/10000

· Substrat OPD = 0,5 mg/ml

Référence de sérum

Titre connu: UI/ml

Densité optique (DO)

492/620 nm

Blanc

Blanc

0,052

Blanc

Blanc

0,066

Sérums négatifs

587/2013

négatif

0,225

588/2013

négatif

0,239

Sérums moyennement positifs

567/2013

13 UI/ml

0,779

436/2013

10 UI/ml

0,842

Sérums fortement positifs

623/2013

237 UI/ml

3,428

650/2013

228 UI/ml

2,952

 

ISTMT-IPT 2012-2013

39

Ces résultats nous permettent de déduire l'absence du bruit de fond puisque le DO du Blanc est de l'ordre de 0,06.

· Dans les cupules des sérums moyennement positifs et fortement positifs il y a apparition d'une coloration orangée traduite par une absorbance de l'ordre de 0,779 et 0,842 (soit un DO > 0,5; 0,5 est le seuil de positivité de notre test ELISA), en effet dans les cupules des sérums négatifs il n'y a pas de coloration et le DO des deux sérums négatifs est inférieur à 0,5.

Tableau 3: Test numéro 2

· Dilution de l'HA = 1/50

· Dilution du sérum = 1/100

· Dilution du Conjugué = 1/10000

· Substrat OPD = 0,5 mg/ml

Référence de sérum

Titre connu: UI/ml

Densité optique (DO)

492/620 nm

Blanc

Blanc

0,069

Blanc

Blanc

0,057

Sérums négatifs

587/2013

négatif

0,220

588/2013

négatif

0,217

Sérums moyennement positifs

567/2013

13 UI/ml

0,715

436/2013

10 UI/ml

0,601

Sérums fortement positifs

623/2013

237 UI/ml

2,328

650/2013

228 UI/ml

2,265

 

Comparé au premier essai seulement la dilution des sérums a changé de 1/50 à 1/100. Ceci confirme l'absence de bruit de fond.

· Dans les cupules des sérums moyennement positifs et fortement positifs il y a apparition de coloration orangée, de même pour les sérums négatifs la DO est toujours inferieure a 0,5.

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? Pour les sérums moyennement positifs et fortement positifs la DO a relativement diminué par rapport a une dilution de sérum de 1/50.

Tableau 4: Test numéro 3

? Dilution de l'HA = 1/100

? Dilution du sérum = 1/100

? Dilution du Conjugué = 1/10000

? Substrat OPD = 0,5 mg/ml

Référence du sérum

Titre connu: UI/ml

Densité optique (DO)

492/620 nm

Blanc

Blanc

0,021

Blanc

Blanc

0,025

Sérums négatifs

587/2013

négatif

0,018

588/2013

négatif

0,020

Sérums moyennement positifs

567/2013

13 UI/ml

0,102

436/2013

10 UI/ml

0,099

Sérums fortement positifs

623/2013

237 UI/ml

0,130

650/2013

228 UI/ml

0,128

 

Dans le 3éme test, le passage d'une dilution à la fois d'HA et des sérums de 1/50 à 1/100 entraine une baisse importante de l'absorbance surtout pour les sérums positifs et en particulier les sérums moyennement positifs dont le DO est devenu inferieur au seuil de positivité.

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41

Tableau 5: Test numéro 4

? Dilution de l'HA = 1/100

? Dilution du sérum = 1/50

? Dilution du Conjugué = 1/10000

? Substrat OPD = 0,5 mg/ml

Référence du sérum

Titre connu: UI/ml

Densité optique (DO)

492/620 nm

Blanc

Blanc

0,030

Blanc

Blanc

0,027

Sérums négatifs

587/2013

négatif

0,111

588/2013

négatif

0,115

Sérums moyennement positifs

567/2013

13 UI/ml

0,609

436/2013

10 UI/ml

0,592

Sérums fortement positifs

623/2013

237 UI/ml

1,824

650/2013

228 UI/ml

1,997

 

Dans le 4ème test nous avons essayé de garder une dilution d'HA à 1/100 et de prendre les sérums à 1/50. Ainsi nous avons obtenu des résultats concordants qui montrent l'absence de bruit de fond. La DO des sérums négatifs est inferieure à 0,5 (seuil de positivité) et pour les sérums moyennement positifs et fortement positifs le signal obtenu est relatif au titre de chaque sérum.

En tenant compte des résultats obtenus avec les 4 essais réalisés nous montrons que dans les conditions des essais 1, 2 et 4 le signal obtenu pour les différents sérums y compris le Blanc est concordant avec les titres préétablis avec le Kit de commerce (Kit SIEMENS Enzygnost ELISA IgG) et aussi dans les conditions préétablies et standardisées pour notre Kit ELISA IgG Pasteur, développé antérieurement dans notre laboratoire.

Pour le lot d'HA que nous avons produit et pour des raisons de rentabilité économique, nous choisissons les conditions de l'essai numéro 4 qui fixe une dilution d'HA à 1/100.

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Cette dilution sera respectée pour l'étape de sensibilisation des plaques dans le procédé de préparation du Kit ELISA IgG Pasteur.

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"Il y a des temps ou l'on doit dispenser son mépris qu'avec économie à cause du grand nombre de nécessiteux"   Chateaubriand