CHAPITRE III : MATERIELS ET METHODES
1- PROBLEMATIQUE :
Durant la grossesse, la femme est sujette à de
nombreuses infections, parmi les plus importantes, nous nous sommes
intéressées à la toxoplasmose congénitale,
qui est responsable de foetopathies graves, d'avortement et de
prématurité. Les manifestations cliniques de la
toxoplasmose congénitale peuvent être
particulièrement graves lorsque la contamination foetale a lieu au cours
du premier trimestre de la grossesse, et il est fréquent que les femmes
enceintes viennent au laboratoire pour effectuer une sérologie
toxoplasmique sans connaître leur statut immunitaire antérieur,
ainsi devant plusieurs cas clinique pouvant faire craindre une
séroconversion précoce chez les femmes enceintes.
2- L'OBJECTIF:
Le but voulu à travers notre étude pratique est
de réaliser un suivi sérologique concernant la recherche des
immunoglobulines IgG et IgM
antitoxoplasmiques chez un certain nombre de femme enceinte.
Autrement dit l'objectif de cette sérologie est d'aider
à la détermination du statut immunitaire.
3- POPULATION ETUDIEE :
Notre étude a été réalisée
au niveau du laboratoire d'analyse médical à Mostaganem durant
une période de 04 mois Janvier- Avril 2006.
La population concernée se compose de 100 femmes
enceintes dont l'age varie entre 17 et 36 ans. Notre échantillon est
réparti comme suite :
(63 immunisées, 37 non immunisées)
4-PRELEVEMENT SANGUIN :
Le prélèvement sanguin se fait chez les malades
de préférence à jeun, au niveau de la veine superficielle
du pli du coude.
Le sang est ensuite recueilli dans des tubes secs.
5- ANALYSE SEROLOGIQUE :
La quantité du sang prélevée est
centrifugée à 5000 tours/ min pendant 5 min, et le dosage
sérologique se fait sur le sérum.
6- LA TECHNIQUE UTILISEE :
Le test sérologique a été
réalisé en technique ELFA (Enzyme linked
fluorescent Assay), sur un automate Mini Vidas
(figure n°16 ) permettant la
mesure d'avidité des IgG et IgM
antitoxoplasmiques, nos résultats sont exprimées en unités
internationales par ml (UI/ml).
6.1-DOSAGE DES IgM :
Principe :
-Le principe du dosage associe la méthode
immunoenzymatique par immunocapture à une détection finale en
fluorescence (ELFA).
-Le cône à usage unique sert à la fois de
phase solide et de système de pipetage.Les autres réactifs de la
réaction immunologique sont prêts à l'emploi et pré
répartis dans la cartouche (Tableau n°4).
-Toutes les étapes du test sont réalisées
automatiquement par l'instrument.
Elles sont constituées d'une succession de cycle
d'aspiration/refoulement du milieu réactionnel.
Tableau n° 04: Description de la cartouche
des IgM (FORTIER et al., 1990)
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Puits
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réactifs
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1
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Puits échantillon
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2
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Diluant sérum : Tampon TRIS (50mmol/l) PH 7,4 +
stabilisants protéiques et chimiques + azoture de sodium 0,9 g/l (300 u
l)
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3
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Tampon de prélavage : TRIS (50mmol/l) PH 7,4 +
stabilisants protéiques et chimiques + azoture de sodium 0,9 g/l (600 u
l)
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4-5-7-8
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Tampon de lavage : TRIS (50mmol/l) PH 7,4 + stabilisants
protéiques et chimiques + azoture de sodium 0,9 g/l (600 u l)
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6
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Conjugué : immuncomplexe (antigène
toxoplasmique souche RH Sabin - anticorps monoclonal de souris anti-P30)
marqué a la phosphatase alcaline + azoture de sodium 0,9 g/l +
gentamycine 0,02 % (400 u l)
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9
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Puits vide
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10
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Cuvette de lecture avec substrat : 4-Méthyl -
ombélliferyl phosphate (0,6 mmol/l) + diéthanolamine (DEA*)
(0 ,62mol/l soit 6 ,6 % PH 9,2) + azoture de sodium 1 g/l (300
ul)
|
-Après une étape de dilution du sérum,
les IgM sont capturées par l'Ac poly clonal
présent sur la paroi du cône.
Les IgM anti-toxoplasmiques sont
détectées spécifiquement par de l'antigène
toxoplasmique inactivé, lui même révélé par
anticorps anti-toxoplasmique conjugué à la phosphatase
alcaline.
-Lors de l'étape finale de révélation, le
substrat(4-Méthyl-Ombelliferyl phosphate) est aspiré puis
refoulé dans le cône ; l'enzyme du conjugué catalyse
la réaction d'hydrolyse de ce substrat en un produit
4-Méthyl-Ombélliferone) dont la fluorescence émise est
mesurée a 450 nm. La valeur de signal de fluorescence est
proportionnelle à la concentration d'anticorps présents dans
l'échantillon.
-A la fin du test, un indice est calculé
automatiquement par l'instrument par rapport au standard S1
mémorisé (Tableau n°5), puis imprimé (FORTIER
et al., 1990).
Tab.n°5: Normes utilisés pour le
dosage des IgM (FORTIER et al., 1990) :
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Indice
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Interprétation
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i < 0.56
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Négatif
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0.55 = i = 0.65
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Equivoque
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i =0.65
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positif
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