2.6.2.4. Technique d'électrophorèse
2.6.2.4.1. Principe
La technique d'électrophorèse consiste à
faire migrer, dans un gel d'agarose, l'ADN amplifié ou
digéré, sous l'influence d'un champ électrique. Cette
migration est fonction de la taille du fragment d'ADN. Les molécules
d'ADN chargées négativement vont migrer de l'anode (-) vers la
cathode (+), les molécules de haut poids moléculaires se
déplaçant moins vite que les molécules de plus faible
poids moléculaires
2.6.2.4.2. Préparation du gel
Deux types de gel d'agarose ont été utilisés
au cours de ce travail:
- un gel à 1,5% pour identifier les espèces du
complexe An. gambiae;
- un gel à 2% pour déterminer les formes
moléculaires M et S d'An. gambiae s.s.
Pour préparer le gel d'agarose à 1,5% (ou 2%),
nous avons mesuré à l'aide d'une éprouvette graduée
100ml de tampon TBE 1X (Tris-borate-EDTA). Dans un erlenmeyer en verre,
l'agarose (1,5 ou 2g) et le tampon ont été
mélangés, puis portés à ébullition sur un
agitateur magnétique chauffant (250°C) pendant 2 à 4
minutes, jusqu'à l'obtention d'une solution translucide ; celle-ci a
été soumise à un refroidissement progressif par trempage
dans un bac d'eau froide. A l'état tiède, nous y avons
ajouté 5ul de BET (Bromure d'éthidium). Après agitation,
le gel a été coulé dans une cuve sur laquelle ont
été suspendus deux peignes. Laissé à la
température ambiante pendant une heure environ pour
polymérisation, le gel est ensuite débarrassé des peignes.
On peut y observer des puits où seront déposées les
solutions d'ADN amplifié ou digéré. Le gel est
immergé dans une cuve de migration contenant du TBE 1X.
2.6.2.4.3. Distribution des échantillons et
migration électrophorétique
Sur un morceau de parafilm, ont été
déposées des gouttelettes de 2ul de bleu de charge (bleu de
bromophénol 0,25% + bleu de xylène cyanol 0,25% + sucrose 4% +
eau distillée) qui permet de maintenir l'ADN au fond du puit et de
contrôler le front de migration. Ensuite, 10ul de chaque
échantillon d'ADN amplifié ou digéré ont
été prélevés et mélangés au bleu de
charge puis déposés au fond du puit. L'embout de la pipette
servant à la distribution des échantillons à analyser a
été changé après chaque dépot. Puis, ont
été déposés sur chaque rangée de puits: un
témoin négatif où l'ADN est remplacé par de l'eau
stérile; 3ul de marqueur de taille connu (Superladder-Low); 3
échantillons témoins d'espèces: An. gambiae
s.s., An. arabiensis et An. melas lorsqu'il
s'agissait de l'identification des espèces; ou des échantillons
témoins des formes M et S lorsqu'il s'agissait de la
détermination des formes moléculaires d'An. gambiae
s.s.
Enfin, notre cuve est fermée et reliée à un
générateur de courant continu (140 volts-500mA); la migration
dure 45 minutes.
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