2.3 Acides aminés
Avant le developpement de la chromatographie d'echange d'ions
(CEI), des acides amines
individuels etaient mesures par des methodes colorimetriques
ou microbiologiques. Bien que
ces methodes aient produit des resultats acceptables, elles
sont aujourd'hui supplantees par la
chromatographie.
Les acides amines contenus dans les proteines doivent d'abord
etre liberes par hydrolyse
et cela constitue l'etape la plus critique de la procedure.
D'habitude, la plupart des acides
amines sont completement liberes par une hydrolyse acide HCl
6M en absence d'oxygene.
Mais le tryptophane est completement degrade dans ces
conditions acides alors que la threonine,la serine et les acides amines soufres
sont aussi partiellement degrades. Des conditions alternatives d'hydrolyse
doivent par consequent etre utilisees pour mesurer le tryptophane.
La cystine et la methionine sont d'habitude protegees par une
oxydation specifique avant
hydrolyse. Les pertes en threonine et serine dependent du
temps, et il est necessaire de
proceder a des series d'hydrolyse pour estimer le pourcentage
de degradation et corriger les
valeurs. Inversement, les acides amines a chaine ramifiee sont
liberes lentement par hydrolyse
et des sequences d'hydrolyses sont necessaires pour une
extraction complete. Les conditions pour l'hydrolyse acide exigent un acide pur
et un ratio important d'acide par rapport a la prise d'essai de l'aliment. Les
aliments riches en glucides reagissent souvent avec les acides amines pendant
l'hydrolyse conduisant a des pertes difficiles a quantifier. Une hydrolyse en
phase vapeur a ete suggeree pour minimiser ces pertes par degradation. Dans
cette methode, l'echantillon seche de l'aliment (ou de la proteine) est
hydrolyse par de l'acide concentre HCl 6M correspond a un acide fumant.
Les acides amines soufres sont d'habitude oxydes avec de
l'acide performique avant
hydrolyse. Une chloration de la tyrosine peut se produire et
l'addition de phenol a l'acide
permet d'en reduire l'effet. L'hydrolyse doit etre realisee
sous courant azote ou, mieux, dans des tubes scelles.
Le tryptophane est mesure apres une hydrolyse alcaline (KOH,
Ba(OH)2 ou LiOH). Il est classique de mesurer la leucine dans l'hydrolysat pour
ajuster les valeurs et les rendre coherentes avec celles de l'hydrolyse acide.
Malgre son instabilite, la ninhydrine reste probablement le reactif le plus
employe, bien qu'un certain nombre de reactifs alternatifs ou de reactifs de
derivatisation pre- et post colonne aient ete proposes. La plupart
de ces autres reactifs ont une sensibilite tres variable. La
chromatographie capillaire en phase gazeuse a aussi ete utilisee, mais la
plupart des reactifs ont des taux de rendement variables,en fonction des
differents acides amines.
Les methodes CLHP offrent des temps reduits d'analyse et
ameliorent les limites de detection d'a peu pres 1 picomole (pmol) .La CLHP
peut etre utilisee pour separer les acides amines, soit sur des colonnes
d'echange d'ions avec derivatisation postcolonne en presence de ninhydrine ou
d'OPA (o-phthaldialdehyde), soit avec une derivatisation precolonne suivie
d'une separation en phase inverse sur octyl- ou octadecyl silice.
On peut determiner le tryptophane en a peu pres 8 minutes par
une methode en chromatographie liquide qui ne necessite pas de derivatisation.
Tableau 4 :Methodes d'analyses des
acides amines
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Procédure
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Applicabilité
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Limites
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Investissements
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Chromatographie d'echange d'ions apres hydrolyse acide(CEI)
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Tous les aliments
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Pertes par hydrolyse des acides amines labiles et liberation
lente des acides amines a chaine ramifiee
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Eleves
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Chromatographie liquide haute performance après hydrolyse
acide (CLHP)
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Tous les aliments
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Voir ci-dessus
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Eleves
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Chromatographie en phase gazeuse apres hydrolyse acide et
derivatisation (CPG)
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La plupart des aliments
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Le choix de produits derivatises est difficile
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Moderes a eleves
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(Acides amines sulfures)
Hydrolyse acide apres oxydation des acides amines sulfures
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La plupart des aliments
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Pertes hydrolytiques
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Eleves
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(Tryptophane)
Hydrolyse alcaline et chromatographie par echange d'ions
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La plupart des aliments
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Pertes hydrolytiques d'autres acides amines
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Eleves
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(Tryptophane, acides amines sulfures) Colorimetrie
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Faibles
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(Lysine disponible) Colorimetrie
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La plupart des aliments
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Faibles
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