1. Discussion
? L'analyse génomique des phages par les enzymes
de restriction
La digestion enzymation a permis de mettre en evidence les
différences entre les phages étudiés. Ainsi, une absence
de bande d'ADN se justifirait soit par l'incapacité de digérer
l'ADN des phages par les enzymes XmnI et XbaI qui pourrait être due
à l'absence de sites cibles pour l'enzyme de restriction testée,
soit par une perte de fragment de petites tailles lors de
l'électrophorèse, soit par une faible concentration d'ADN
où encore lors de l'extraction de l'ADN génomique. Cette
hypothèse a été rapportée par certains auteurs qui
pourrait être probablement due à une dégradation de l'ADN
durant le processus (Wong et al., 2004) ou à
sa méthylation (Xydas et al., 1996).
En effet, l'analyse du profil de restriction des phages ö
T4 et ö Ebrios a montré que leurs génomes sont
supérieurs à 10000 Kbp. Le matériel génétque
de ces phages est du type ADN double brin. Ces résultats confirment des
travaux antérieurs pour les phages ö T4 et ö Ebrios avec des
génomes respectifs de 168903 bp et 39 752 pb (Szermer-Olearnik
et Boratyñski, 2015 ; Ngazoa-Kakou et al., 2018). Par
contre les phages ö A5a, öM3, öM7 montrent des profils dont le
génome est également supérieur à 10000 Kbp.
Plusieurs études ont montré la caractérisation
moléculaire grace aux enzymes de restriction des phages à
Pseudomonas aeruginosa (Kumari et al., 2009
, Essoh et al., 2015), Salmonella
enterica (Lappe et al., 2009), et klebsiella
pneumoniae (Hsu et al., 2013).
Enfin, la non-reconnaissance des sites de restriction de
l'enzyme démontre la limite de la méthode pour les phages
à ADN double brin.
? L'analyse génomique en champ
pulsé
L'électrophorèse en champ pulsé est une
électrophorèse sur gel d'agarose utilisant des champs
électriques alternés. Les changements de direction des
molécules en fonction de leur structure tridimensionnelle durant la
migration font varier leur distance totale de migration (Lai et
al., 1989). L'électrophorèse en champ pulsé
sur gel d'agarose a connu un important essor parmi les techniques
d'étude des génomes (Safa et al.,
2005). Cette technique utilise des enzymes de restrictions pour
générer des profils typiques à chaque souche
bactérienne où phagique. L'utilisation des enzymes
supplémentaires dans le PFGE permet d'offrir une meilleure
discrimination possible des modèles les plus faciles à
interpréter d'où l'intérêt pour nous d'utiliser le
XbaI et le XhoI.
Les résultats obtenus dans cette étude sont
similaires aux travaux antérieurs de Clokie et Kropinski,
2009, qui a utilisé les gros coliphages purifiés dans
l'optimisation de l'électrophorèse en champ pulsé sur gel
d'agarose. En effet, les résultats obtenus par le PFGE ont
été analysés par le logiciel Bionumerics®, il nous a
permis d'estimer la taille du génome des phages ö A5a, ö M3,
ö M7, ö M11 et
42
Résultats et Discussion
ö T4 qui est supérieure à 164 Kb. Le phage
Ebrios n'a aucune bande concernant les deux enzymes de restrictions
utilisées. Cela s'expliquerait par une absence totale de
molécules d'ADN, ce qui signifierait que les molécules d'ADN ont
été dégradées ou détruites où soit
par une insuffisance de molécules d'ADN due à la méthode
de concentration et de purification des phages utilisant le PEG et le NaCl.
Cette absence de bande pourrait être due
également par une incapacité de l'endonucléase a
dégradé la molécule d'ADN où encore une absence de
sites de restriction. Cette notion d'absence de bande a été
rapportée par certains auteurs qui pourrait être probablement
dû à une dégradation de l'ADN durant le processus
(Wong et al., 2004) ou à sa méthylation
(Xydas et al., 1996).
En effet, des différences entre les phages ont
été obtenues par les profils de restriction PFGE par rapport
à la méthode de digestion enzymatique. Le PFGE a un pouvoir
discriminant plus élevé que la digestion enzymatique. De plus, la
PFGE peut s'avérer longue à mettre en oeuvre et souffre d'un
manque de reproductibilité inter- (voire intra-) laboratoires. Ainsi, le
pouvoir discriminant du PFGE a été soutenu par (Hsu
et al., 2013 ; Czajkowski et al., 2015 ; Krasowska et al.,
2015 ; Wang et al., 2016) caractérisant le
génome de nouveaux phages lytiques comme candidats potentiels pour la
phagothérapie et le biocontrôle des aliments en industrie
agroalimentaire.
D'autres travaux antérieurs ont étudié
les différents facteurs influençant les résultats de
l'électrophorèse en champ pulsé, incluant la
préparation des plugs d'agarose, la lyse des cellules bactérienne
ou phagique, la digestion enzymatique (Mulvey et al., 2001 ;
Murchan et al., 2003 ; Zhang et al., 2007), ainsi
que les paramètres électrophorétiques à savoir le
temps total de migration, influençant la distribution des fragments de
restriction dans le gel et donc influence le pouvoir discriminatoire de la
technique
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