2.4. Isolement et purification
L'isolement a été réalisé par
ensemencement de la culture d'enrichissement (dans le bouillon nutritif) par
épuisement dans un milieu sélectif des bacilles à Gram
négatif non fermentants : le milieu Mac Conkey puis incubation les
boites pendant 24 heures à 37°C.
La purification s'est effectuée par le
réensemencement de chaque colonie suspecte sur les mêmes milieux
sélectifs. La pureté des souches est révélée
par des colonies homogènes ayant le même aspect
phénotypique (couleur, taille et forme).
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Matériel et Méthodes
2.5. Conservation des souches
Les souches ainsi ré-isolées et purifiées
sont repiquées dans des tubes de gélose nutritive inclinée
(GNI), incubées à 37°C pendant 24 heures puis
conservées au réfrigérateur à une
température de 4°C.
2.6. Coloration de Gram
Apres vérification de leur pureté, les isolats
bactériens ont été soumis aux examens microscopiques
après la coloration de Gram.
2.6.1. Principe
Le but de cette coloration est de déterminer la
morphologie et l'aspect pariétal des bactéries à Gram
négatif non fermentants.
2.6.2. Technique
A. Réalisation de frottis
> Sur une lame, déposer une goutte d'eau physiologique
stérile ;
> Ajouter à l'aide d'anse de platine
stérilisée une fraction de colonie bien isolée ;
> Étaler et fixer à la chaleur (au-dessus de
flamme de bec bunsen) ;
> Poser la lame séchée sur le portoir reposant
sur un bac de coloration.
B. Réalisation de la coloration
Voici succinctement les différentes étapes de cette
coloration :
> Coloration par le violet de gentiane : Laisser agir de 30
secondes à 1 minute. Rincer à l'eau de robinet ;
> Mordançage au lugol (solution d'iode
iodo-iodurée): étaler le lugol et laisser agir 30 secondes,
Rincer à l'eau de robinet ;
> Décoloration (rapide) à l'alcool
(+acétone): verser goutte à goutte un mélange alcool
acétone sur la lame inclinée obliquement, et surveiller la
décoloration (5 à 10secondes). Rincer sous un filet d'eau de
robinet ;
> Recoloration à la fuchsine : laisser agir de 30
secondes à 1 minute. Laver doucement à l'eau de robinet ;
> Sécher la lame et observer au microscope optique
à objectif 100 à l'immersion.
2.6.3. Lecture
Les bactéries Gram positif apparaissent en violet
foncé tandis que les bactéries Gram négatif sont
colorées en rose
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Matériel et Méthodes
2.7. Test d'oxydase 2.7.1. Principe
Ce test permet la mise en évidence d'une enzyme la
phénylène diamine oxydase de la bactérie à partir
de leur culture en milieu gélosé. Cette enzyme est capable
d'oxyder le réactif : N dimethyl para phénylène diamine
qui est incolore, et en présence de l'enzyme, il libère un
composé bleu violacé.
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