5- La multiplication de P. infestans :
Nous avons deux méthodes proposées pour multiplier
P. infestans, soit sur :
1) les feuilles ou les tranches de pomme de terre.
2) la culture pure sur les plaques agar-agar.
5.1- les feuiles ou les Tranches de Pomme de terre :
Nous multiplions souvent P. infestans sur les
feuilles ou les tranches de pomme de terre; essentiellement pour la production
d'inoculum, mais aussi pour la conservation de ce dernier.
5.1.1 Le fait de récolter de sporange et de
zoospores :
1. les sporanges sont lavés du côté
supérieur d'une lésion sporulant, sur une tranche de pomme de
terre ou une feuille de tomate avec de l'eau distillée, puis
tamisée à l'E1de1d'cn filtre maille de 30 micron pour enlever les
mycéliums et d'autres débris.
2. Le filtrat est alors passé par un filtre de maille
de 10micron, qui piège les sporanges. Ceux-ci sont lavés
plusieurs fois avec de l'eau potable et recueillis ensuite, du filtre avec une
petite quantité d'eau distillée.
3. Cette suspension sporangial est incubée à
6°C pendant 2 heures pour inciter la libération des zoospores. Si
on veut séparer les sporanges des zoospores, la suspension est de
nouveau passée par le filtre de maille de 10micron, dès que les
zoospores ont été libérés et le filtrat, qui en
contenant seulement les zoospores, est recueilli. La suspension de zoospore est
inoculée sur les tranches de tubercule ou les feuilles de pomme de terre
(en cas d'inoculum de pommes de terre) pour garder la croissance de
champignon.
5.1.2 L'inoculation de tubercules :
1. Choisisses des tubercules parmi les variétés
susceptibles, moyennes de grandeur si disponible, sans pourritures ni dommage
sévère ou coloration verte.
2. Laver les tubercules et laisser sécher.
3. stériliser La surface des tubercules en les piquant
dans l'alcool de 70 % durant quelques secondes, et les faire de décaper
au chalumeau.
4. Avec un couteau trempé dans l'alcool et
décapé au chalumeau, coupez la pomme de terre en tranches
épaisses d'environ 1 centimètre. Chaque tranche devrait avoir
deux surfaces de coupe. Débarrassés L'extérieurs la
plupart des parties des tubercules. Placez les tranches de pomme de terre sur
un filet de fil stérilisé dans les boîtes peu profondes de
plastique menus de papier filtre humide au fond. Le filet devrait être
à au moins 1 centimètre au-dessus du fond
du plateau. Deux gouttes de sporange ou de la suspension
zoospore seront placées sur les tranches de tubercule, les boîtes
sont fermées et placées dans une chambre humide et l'incubation
suit à 15-18°C pendant 1 semaine.
5.1.3 L'inoculation de feuilles :
1. Le prospectus de coupe se fait des feuilles
complètement développés de pomme de terre,
cultivées n'ayant pas atteint le stade de la floraison placées
dans de l'eau douce. Les feuilles doivent être en bonne état sans
signes de maladie ou de stress.
2. Rincer les feuilles et tapoter-les pour les
sécher.
3. laisser le côté axial en haut vers les
couvercles de boite pétri, inversés contenant la gélose
diluée, et inoculer avec deux gouttes du sporogone ou de la suspension
zoospore du P. infestans.
4. incubation à 15-18°C pendant 1 jour dans
l'obscurité, ensuite de 6 jours à un cycle de lumière de
14 heures. Pour la conservation de cultures de P. infestans, l'une ou
l'autre de ces deux procédures, peut être
répétée une fois par semaine. Seulement les spores
formés sur le côté non-inoculé des tranches de pomme
de terre ou de feuilles sont récoltées. Pour la production
inoculum, les spores du côté inoculé des tranches ou des
feuilles peuvent aussi être récoltées. Si aucune colonie
bactérienne n'est visible.
Une note sur la contamination! Soyez prudents avec la
contamination de tranches de tubercule (et part dans une certaine mesure) avec
Erwinia et d'autres organismes qui peuvent attaquer la pomme de terre.
Inoculez toujours des tranches de tubercule très propres (la filtration
comme ci-dessus) et diluez les quantités d'inoculum. Une goutte de 10
micron pour environ 50 zoospores fera attention à la contamination.
Comme Aussi, vous pouvez juste transférer des morceaux d'hyphe et de
sporange.
Sur les plaques agar-agar Fondamentalement toutes ces recettes
viennent de Catin et les Mouvements d'esquive (Caten, 1968; Caten, 1970) et
peut avoir été légèrement modifié par le
laboratoire de Bill Fry dans Cornell.
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