Avantages et inconvénients de la
méthode
Avantages :
L'immunomarquage du c-Fos est extrêmement précis.
On est en mesure de localiser précisément les cellules
marquées. De plus, l'analyse quantitative peut être faite
simplement par le comptage de noyaux marqués.
L'emploi de cette méthode permet de travailler sur des
animaux éveillés car l'usage d'anesthésiques n'est pas
indispensable comme lorsqu'on utilise l'éléctrophysiologie.
Le couplage de l'immunomarquage du c-Fos avec d'autres
techniques de marquage ou de traçage permet de caractériser les
neurones activés. De cette façon, il a été
démontré qu'une part importante de neurones exprimant le
c-fos, en réponse à une stimulation nociceptive,
expriment aussi c-Jun B et le gène de préprodynorphine.
Il a également été démontré que les neurones
immunoréactifs pour c-Fos envoient des projections vers les structures
supraspinales.
Inconvénients :
La stimulation capable d'induire l'expression du c-fos
doit être très forte et assez longue.
Comme il a été mentionné plus haut, il
n'y a pas de rapport direct entre les signes comportementaux de la douleur et
l'expression du c-fos. On est en mesure de supprimer les signes
comportementaux par administration d'analgésiques, alors qu'un marquage
c-Fos non négligeable persiste.
De plus, tous les neurones, lorsqu'il sont activés
n'expriment pas c-fos. Ceci nous oblige à faire très
attention lors de l'interprétation des résultats. L'absence de
marquage ne correspond pas forcément à une absence
d'activité. De même, la présence d'un immunomarquage c-Fos
n'est pas le signe direct de l'activité nociceptive.
Il est touj ours difficile de déterminer quel est
l'événement exact responsable de l'induction du c-fos.
Par exemple, un marquage c-Fos peut être induit par le stress
provoqué lui-même par la douleur. Il peut correspondre
également à l'activité locomotrice en réponse
à la stimulation nociceptive, ou même, être induit par
l'interruption du sommeil4.
Les protocoles expérimentaux doivent, donc, être
construits avec soin et comporter de nombreux groupes témoins afin
d'éviter une mauvaise interprétation des résultats.
Pour réellement comprendre ce qui se produit, il est
surtout indispensable de comprendre le rôle et le mode d'induction du
c-fos.
4 Le rat étant un animal nocturne, toutes les
expériences effectuées le jour perturbent son cycle de
sommeil.
Induction du c-fos
Selon les études menées sur les cultures
cellulaires, il existe deux voies d'induction du cfos. L'une met en
jeu l'activation de inositol-phosphate-protéine-kinase-C (SRE -
serum response element), et l'autre une augmentation de la concentration
intracellulaire du Ca2+.
Il a été établi que les protéines
provoquant l'induction du c-fos sont activées par une
transformation post transcriptionelle (phosphorylation), ce qui peut expliquer
la rapidité de l'induction du c-fos.
Une expérience (menée par HUGHES ET DRAGUNOW(cf.
V), 1995) établit qu'une inhibition de
la synthèse protéique aboutit à une
induction fulgurante du gène c-fos. Cela fait penser que les
protéines synthétisées de novo sont
nécessaires pour inhiber la transcription du c-fos. Et c'est
justement le produit du gène c-fos, la protéine c-Fos,
qui inhibe sa propre transcription ( trans-répression). Ce
mécanisme de trans-répression ne concerne que la voie SRE.
L'existence de régions non traduites, riches en AT dans
l'ARNm du c-fos se traduit par une instabilité de la
molécule, donc par une demi-vie courte. De cette façon, la
régulation est facilitée et peut être d'autant plus facile
et rapide.
Une fois synthétisée, la protéine c-Fos
se couple avec la protéine c-Jun à l'aide de séquences
« leucine zipper » pour former un hétérodimère
qui se lie au site activateur AP- 1 sur l'ADN, et active la transcription des
gènes cibles.
Plus globalement, c-Fos est impliquée dans une cascade
de signaux de transduction - provoquée par des événements
extracellulaires - qui est responsable de changements intracellulaires à
long terme.
Le rôle de la cascade de transcription dont c-Fos fait
partie, pourrait être de modifier la réponse nociceptive en
induisant des changements dans les voies nociceptives spinales qui aboutissent
à une augmentation de la sensibilité à la stimulation
nociceptive (hyperalgie), ou à une réponse de type nociceptif
à une stimulation non nociceptive (allodinie) (Zimmermann &
Herdegen, 1994). Ces conclusions proviennent des expériences montrant
une surexpression spinale du c-fos après les manipulations
provoquant une hyperalgie ou une allodinie5, et de celles qui
montrent que cette expression du c-fos est réduite après
traitement par les antagonistes des récepteurs NMDA ainsi que par les
inhibiteurs de la NO-synthase6.
Une autre façon dont Fos peut agir implique un
processus contraire : l'inhibition de la transmission nociceptive dans la
moelle épinière. Les événements provoquant une
hyperalgie ou une allodinie induisent l'expression de la dynorphine, un peptide
opioïde ayant des effets analgésiques connus, dans la partie
dorsale de la moelle7. Le double marquage montre la co-localisation
de la dynorphine et de la c-Fos pour plus de 80% de neurones marqués
positivement au c-Fos, après une stimulation nociceptive inflammatoire.
L'ordre d'apparition des deux protéines suggère que l'expression
de la préprodynorphine
5 (Hunt, Pini & Evan 1987 ; Ma. Q. P. & Woolf, 1996 ;
Menetrey, Gannon, Levine &Basbaum, 1989 ; Noguchi, Kowalski, Traub,
Solodkin, Iadarola & Ruda, 1991 ; Presley, Menetrey, Levine & Basbaum,
1990 ; Williams, Evan & Hunt, 1990)
6 (Chapman, Honoré, Buritova & Besson, 1995 ;
Kenl,Gogas, Lichtblau, Pollock, Mayers, Basbaum & Wilcox, 1991 ; Roche,
Cook, Wilcox & Kajander, 1996)
7 (Iadarola, Douglass, Civelli & Naranjo, 1988 ;
Iadarola,Brady, Draisei, & Dubner, 1988 ; Millan.M.J., Millan.M.H.,
Pilcher, Czlonkowski, Herz & Colpaert, 1985, 1986 ; Ruda, Iadila, Cohen
& Young, 1988 ; Weiche, Millan.M.J. Holt, Nohr & Herz, 1989)
pourrait être régulée par la c-Fos. Les
arguments directs confirmant cette théorie ont été
apportés par Hunter et al. (1995) qui a constaté que les rats
chez qui on a bloqué spécifiquement la synthèse de la
protéine c-Fos par injection d'oligo-désoxynucleotides antisens
ARNm du c-fos, lorsqu'ils ont reçu une stimulation nociceptive
(par injection de formol dilué dans la patte), ne synthétisent
plus d'ARNm de la préprodynorphine. On observe également une
diminution du seuil de la réponse à la douleur lors du test du
formol.
Fos apparaît donc comme étant impliquée
dans un mécanisme d'inhibition de la transmission nociceptive lors d'une
stimulation intense ou prolongée.
Expression spin ale de la protéine c-Fos lors de la
parturition chez le rat, mise en évidence par l'immuno-marquage
Etude préliminaire - Expression neuronale de la
protéine c-Fos dans la moelle épinière lors de la
parturition chez la rate primipare et multipare
L'expérience qui a précédé celle
à laquelle j'ai assisté avait pour but d'étudier
l'expression de la protéine c-Fos au niveau de la moelle
épinière chez la rate primipare et multipare. Voici un bref
résume de cette expérience. Les mêmes techniques ont
été utilisées dans l'experience qui l'ont suivi. Les
techniques seront donc détaillées dans la description de
celle-ci.
A J-2 1 de gestation, les rates reçoivent oralement une
dose de 5mg/kg de mifepristone ( RU-486 ) ce qui provoque une «
synchronisation » des naissances. Chez les primipares, 3 délais
après l'expulsion du premier petit ont été
étudiés : 1, 2 et 4h. Chez les multipares le délais de 2h
a été choisi, car les études préalables ont
montré que ce délai correspond à une forte l'expression de
c-Fos.
Au délai choisi, la rate est anesthésiée
et perfusée. Les segments T12 à S2 sont prélevés et
préparés selon les méthodes classiques pour la coupe au
microtome. Les coupes flottantes de 40 um sont traitées par la
méthode immunohistochimique indirecte (Avidine/Biotine). Les neurones
immunopositifs (F+) sont ensuite comptés dans 6 à 10 coupes, non
sériées, par segment.
Résultats : Chez les primipares, des neurones F+
sont présents bilatéralement dans tous les segments
étudiés. Ils prédominent en L5-S1
où le SPN8 présente un forte densité
de neurones F+. La distribution laminaire varie le long de la moelle
épinière. L'administration du RU-486 n'a pas d'effet significatif
sur l'expression de la protéine c-Fos. Les neurones F+ sont
présents dans toutes les couches. Ils sont les plus nombreux dans les
couches ventrales et leur distribution est la suivante :
Couches ventrales > couches V -VI > III - IV > X >
I - II
Quelques moto-neurones du VM sont F+ en L4-L5. Le nombre total
de neurones F+ n'est pas significativement différent entre 1h et 2h,
mais diminue significativement à 4h.
Expression neuronale de la protéine c-Fos dans la moelle
épinière chez la rate
8 noyau parasympathique spinal
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