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Qualité des produits halieutiques : dosage des teneur en histamine, azote basique volatile total (abvt) et du taux des sulfites dans quelques produits de pêche

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par Noureddine EL BARAKA
Université Ibn Zohr, Agadir - Master 2009
Dans la categorie: Biologie et Médecine
  

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Chapitre II

Méthodes utilisées dans cette étude :

description

II. Introduction

Ce travail purement expérimental a été effectué dans deux laboratoires d'analyses : le Complexe Industriel et commercial belhassan-CIBEL et le Laboratoire Régional d'Analyses et de Recherches Vétérinaires d'Agadir (LRARVA). Ces deux établissements entretiennent des relations de collaborations scientifiques avec les établissements de l'Université Ibn Zohr, en l'occurrence la Faculté des Sciences d'Agadir.

Le LRARVA a été crée en 1980 pour couvrir les besoins de la zone de sud du Maroc en matière d'analyse et contrôle de qualité des produits agro-alimentaires et halieutiques. Après une période de formation du personnel et la mise en place des équipements, le laboratoire a démarré ses activités techniques en 1985. Le laboratoire est organisé en 4 sections (section administrative, section qualité, section appui et logistique et section technique). Quant au Laboratoire CIBEL, il est fondé en 1989, c'est une unité active dans le secteur « Produits des industries alimentaires » et dont l'activité principale est le contrôle de la qualité des poissons et produits de la pêche préparés.

II.1. Détermination de l'ABVT dans les produits de mer

Comme signalé auparavant, l'ABVT est un des critères utilisés pour évaluer l'altération des produits de la mer. Il résulte principalement de la dégradation des protéines par l'action des bactéries ou enzymes présents dans la chair des poissons. Son dosage reste l'une des méthodes les plus anciennement utilisées dans ce domaine. Il permet de déterminer la teneur totale en azote des bases azotées volatiles (NH3, DMA, TMA et R-NH2) résultant de la dégradation des composés azotés protéiques et non protéique du poisson. (Schéma 1)

Hydrolys

Protéine

Acides

Schéma 1 : Dégradation des protéines

La DMA et la TMA sont produites à partir de l'oxyde de triméthylamine (OTMA) dont la teneur varie d'une espèce à une autre. Les transformations de TMA génèrent les mauvaises odeurs et celles de la DMA en présence du formaldéhyde (un polluant ubiquiste des écosystèmes naturels) conduisent au durcissement de la chair du poisson.

II.1.1. Principe de la méthode utilisée

Après l'extraction des protéines d'un échantillon du poisson (100 g de chair prélevée dans trois endroits différents du corps) à l'acide perchlorique (HClO4), l'extrait obtenu subit une distillation suivie d'une neutralisation de l'ABVT (essentiellement des bases volatiles) via l'acide chlorhydrique. Afin d'alléger le manuscrit, nous avons opter de présenter le mode opératoire sous formes des points suivants :

II. 1.2. Procédure expérimentale

Pour garantir la fiabilité et la répétabilité des résultats, tous les produits chimiques que nous avons utilisé sont d'une pureté analytique (HPLC grade): les solutions sont préparées dans de l'eau déminéralisée ; une attention particulière a été réservée à la préparations des réactifs (acide perchlorique (HClO4, 0,6 mg. L-1), soude caustique 2 g. L-1 et une solution standard d'HCl (0,05 N)) dans le but de minimiser les sources d'incertitudes. Dans notre cas, un appareil de distillation automatique est utilisé et par conséquent le titrage est réalisé à l'aide d'une solution standard d'HCl (0,01 N). (Schéma 2)

Schéma 2 : Les étapes de détermination de l'ABVT

Mode opératoire

Après avoir hacher soigneusement l'échantillon à analyser, on pèse 10 g qui sont broyés dans récipient approprié puis mélangés à 90 ml de solution d'acide perchlorique (0,6 mg. L-1). Un mélangeur rapide assure l'homogénéisation de la solution obtenue. L'extrait ainsi obtenu, après filtration, est parfois conservés pendant 7 jours à une température comprise entre 2 et 6 °C. Une quantité de 50 ml de l'extrait obtenu est ensuite placée dans un appareil de distillation à la vapeur. On vérifie l'alcalinisation du milieu par l'ajout de quelques gouttes de phénophtaléine. Avant de démarrer le processus de distillation, quelques gouttes d'agent anti-moussant à base de silicone et un volume de 6,5 ml de soude caustique (2 g. L-1) sont introduits dans le milieu réactionnel. Après mélange, NaOH neutralise le HClO4, selon l'équation :

NaOH + HClO4 NaClO4 + H2O

Il y a un excès de NaOH et cela libère les amines en solution, selon la réaction:

NH4 + + OH- NH3

La distillation à la vapeur est ajustée de façon à produire 100 ml de distillat au bout de 10 minutes. Les bases volatiles entraînées sont recueillies dans une solution d'acide borique (100 ml à 0,3 g. L-1) en présence d'indicateur de Tachiro.

La réaction des amines volatiles avec l'acide borique est :

NH3 + H3BO3 NH3-H3BO3

Les amines volatiles contenues dans la solution d'acide borique sont ensuite titrées par une solution étalon d'HCl (0,01 N). Un essai à blanc est toujours effectué dans les mêmes conditions que l'échantillon.

La teneur en ABVT par titrage de la solution d'acide borique contenue dans le récepteur est déterminée à partir de l'équation :

(V

100

- V )

ABVT(mg N/100 g chair) = 1 2 0,14 2

X X

m

V1 = volume en ml d'HCl 0,01 N versé.

V2 = volume en ml d'HCl 0,01 N pou neutraliser le blanc. m = masse de l'échantillon en g.

II.2. Dosage de l'histamine dans les produits de mer

L'histamine est une amine provenant de la dégradation de l'histidine (acide aminé présent à forte dose dans certains poissons) par décarboxylation. Sa présence, à des teneurs supérieures à 10 mg/100g dans des poissons, est susceptible de provoquer des phénomènes d'intoxication. La formation d'histamine est très rapide lorsque les conditions de température, de pH et de la salinité sont favorables.

Le principe du dosage de l'histamine consiste à solubiliser cette amine dans de l'acide trichloracétique (TCA) suivie d'une séparation sur une colonne chromatographique échangeuse d'ions. L'éluant obtenu est complexé avec l'orthophtalaldéhyde (OPA) comme agent dérivatisant pour former un dérivé flourophore (His-OPA), facilement détectable par fluorimétrie aux longueurs d'onde d'émission et d'excitation respectives de 450 et 360 nm,

Histidine Histamine

Figure 1: Schéma simplifié de la réaction de formation de l'histamine

II.2.1. Procédure expérimentale

En vue d'être dans les conditions réelles de l'extrait d'histamine des produits halieutiques, la solution mère d'histamine 1000 ppm est préparée dans HCl (0,1 N) : 1 g d'histamine est placé dans une fiole jaugée (1 L). Les solutions filles 10 Òg/ml (10 ppm) sont ensuite préparées à partir de la solution mère.

Le dérivé fluorescent est formé classiquement dans une série de fiole à partir des volumes d'histamine (vHis) et d'OPA (v (OPA)).

Figure 2 : Schéma de la réaction de complexation : His-OPA

Après avoir hacher soigneusement l'échantillon représentatif de poisson, 10 g de la masse broyée sont placés dans un récipient auquel 90 ml de solution d'acide trichloracétique (10%) sont ajoutés. L'homogénéisation du mélange est réalisée via un mixeur rapide. Une aliquote de 0,2 ml de l'extrait obtenu après filtration, est ajoutée à 20 ml d'une solution tampon (acétate de sodium + acide acétique) de pH = 4,6. Ce mélange est ensuite chromatographie via une colonne remplie de résine échangeuse d'ions selon le mode suivant : (i) l'addition de 30 ml du tampon comme phase mobile, (ii) l'élimination des substances non fixées est réalisée par l'ajout de 100 ml du tampon.

Ensuite, les amines retenues par la résine, sont élués par l'ajout de 20 ml (HCl, 0,2 N). Comme pour les autres méthodes, un blanc traité exactement dans des conditions similaires que l'échantillon est toujours préparé.

Une fois l'histamine élué, elle est récupérée dans un bêcher, 2 ml de l'éluât sont prélevés et ajoutées au mélange dérivatisant préalablement préparé (1 ml de NaOH (1 N) , 100 uL de l'OPA à 0,1 g. L-1).

Comme nous l'avons déjà mentionné, le complexe fluorescent est relativement instable en milieu basique, c'est pour cette raison, on ajoute 2 ml d'HCl (0,7 N) pour le stabiliser.

Le taux d'histamine en mg d'histamine /100g de poisson est égal à :

Hist(mg N/100

g

chair)

(F1

-

F2

) 18

)

(F3

-

F2

F1 : fluorescence de l'échantillon.

F2 : fluorescence du blanc.

F3 : fluorescence du standard.

II.2.2 Etalonnage du fluorimètre


· Préparation des solutions

La Solution mère d'histamine à 1 g/litre. Dans une fiole jaugée d'un litre son introduite 1,673 g d'histamine, 2 mL d'HCl et compléter au trait de jauge avec HCl 0,1 N. Solution fille 10 Òg/ml (10 ppm). Introduire 1 ml de la solution mère dans une fiole jaugée de 100 ml et compléter au trait de jauge par l'HCl 0,2 N.

Tableau 3 : Mode de préparation des solutions étalons,

Numéro de l'étalon

Volume à prélever de la
solution fille (10 ppm) en
ml, *

Concentration de l'étalon
en (ppm)

1

0,22

0,022

2

0,5

0,05

3

0,8

0,08

4

1

0,1

5

1,33

0,133

6

1,8

0,18

7

2

0,2

* volume final en HCl. 0,2 N = 100 ml

Le fluorimètre est étalonné si le coefficient de corrélation de la régression linéaire est supérieur à 0,75 (R2 > 0,75). Un exemple de valeurs utilisées pour établir la droite de calibration est consigné dans le tableau 4. La figure 3 illustre la droite d'étalonnage obtenue.

Tableau 4 : Exemple de calibration du fluorimètre,

Numéro de
l'étalon

Concentration de l'étalon
en (ppm)

Fluorescence
correspondante

1

0,022

20 #177; 9

2

0,05

45 #177; 3

3

0,08

70 #177; 13

4

0,1

90 #177; 10

5

0,133

120 #177; 2

6

0,18

160 #177; 6

7

0,2

180 #177; 12

R2: représente le coefficient de corrélation

0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25

C (ppm)

Signal de Fluo (u ar.)

200

150

100

50

0

y = 895,65x
R2 = 0,9997

Figure 3 : Droite d'étalonnage représentant l'intensité du fluorescence
en fonction de la concentration (ppm), la pente est de 895,65, et R2 = 0,9997

? Fluorimetre :

Trilogy Turner est un instrument de laboratoire compact pour la fabrication de fluorescence, les conditions de travail sont :

- Longueur d'onde d'excitation: 360 nm ; - Longueur d'émission: 450 nm ;

- Sensibilité : moyenne ;

- Nombre de cycle: 1 ;

- Réponse : 0.02 sec;

- Courbe de calibration: linéaire ;

- Expression : Int = A + B * Conc ; - Standard blanc : 0.000 ;

II.3.Détermination du taux de dioxyde de soufre II.3.1 Introduction

Le noircissement des crevettes est causé par une réaction chimique d'oxydation des constituants de la carapace (tyrosine notamment), similaire à la réaction qui prend place lors du bronzage suite à l'exposition au soleil.

La mélanine, responsable du noircissement se forme sous l'action de la tyrosinase contenue dans le sang qui oxyde la tyrosine libre existant dans les tissus soit à l'état naturel, soit après hydrolyse bactérienne.

La tyrosinase est connue pour oxyder directement l'orthodihydroxyphénol (DOPA). Les quinones résultant de cette oxydation se polymérisent pour donner des pigments dont la couleur varie avec la nature du substrat (IFREMER a, 1991).

(Brun)

Mélanine

Oxydation enzymatique

(Pâle) Quinone (Jaune)

Substrats intermédiaires

Polymérisation

Schéma 3 : des réactions chimiques impliquées lors du phénomène de noircissement.

II.3.2 Détermination du dioxyde de soufre par la méthode de Monier-Williams modifiée

Cette méthode décrite le dosage de SO2 total dans les crevettes ou tout autre produit de la mer. Il se base sur l'entraînement, par un courant d'azote, du dioxyde de soufre extrait du produit acidifié et chauffé, sa fixation et son oxydation par barbotage dans une solution neutre

diluée de peroxyde d'hydrogène puis le dosage de l'H2SO4 formé par une solution titrée de NaOH. (Norme AFNOR VO3- Mai 1975).

Pour assurer la répétabilité des résultats, tous les réactifs que nous avons utilisés sont d'une pureté analytique reconnue. Les solutions sont préparées dans de l'eau déminéralisée.

La figure 4 illustre le schema du montage utilisé pour la distillation et le dosage de SO2 dans les crevettes : (A) ballon rodé, (B) réfrigérant, (C) ampoule d'incubation d'HCl, (D) ampoule à barbotage.

Avec une précision de 0,01 g, on pèse entre 10 g et 100 g de l'échantillon qui est broyés dans un récipient approprié puis mélangés à 100 ml d'eau avant d'introduire l'ensemble dans le ballon (A), pour favorise la réaction ci-dessous :

Na2S2O5 + H2O 2 NaHSO3

On place dans l'ampoule (C) 50 ml de solution d'acide chlorhydrique à 100 g.L-1, ensuite on mets dans le barboteur (D) 3 ml de solution de peroxyde d'hydrogène à 3 % plus 0.1 ml d'indicateur coloré (bleu de bromophénol), la solution de peroxyde d'hydrogène est neutralisé par la solution d'hydroxyde de sodium 0,01 N. La circulation est fait par un courant d'azote pour chasser l'air contenu dans le ballon et dans l'ensemble du dispositif. On verse dans le ballon (A) la solution diluée d'acide chlorhydrique contenue dans l'ampoule (C) et on porte lentement le contenu du ballon à ébullition qui est maintenue tout en faisant circuler régulièrement l'azote à raison d'une à deux bulles par seconde.

La réaction mise en joue est comme suit:

HSO3 - + HCl SO2 + H2O

En général, le dioxyde de soufre est entraîné en 15 minutes, mais il est quelquefois nécessaire de prolonger davantage l'opération d'entraînement par la réaction suivant :

SO2 + H2O2 H2SO4

On peut vérifier si l'entraînement du dioxyde de soufre a été total en remplaçant le barboteur par un autre contenant une nouvelle charge de 3 ml de solution de peroxyde d'hydrogène neutralisée. Le SO2 piéger dans la solution de peroxyde d'hydrogène est ensuite titrées par une solution étalon NaOH (0,1 N). Effectuer deux déterminations sur le même échantillon pour essai.

La teneur en dioxyde de soufre, exprimée en milligrammes par kg d'échantillon (ppm) est égale à :

SO

V 3,2 10

2 (ppm) = x

m

3

m = masse en grammes de la prise d'essai. V = volume en ml de NaOH utilisé.

Figure 4 : Appareil utilisé pour la distillation et le dosage de SO2, (A) ballon rodé, (B) réfrigérant, (C) ampoule d'incubation d'HCl, (D) ampoule à barbotage.

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