II. Purification de la
lipase de crabe vert
Préparation de
l'homogénat
30 g de tissu frais de l'hépatopancréas de crabe
sont homogénéisé dans 30 ml de tampon 20 mM Tris-HCl, 100
mM NaCl, 2 mM benzamidine, pH 8 (tampon A) à l'aide d'un mixeur (Waring
blender) 2 x 30 secondes puis centrifugé 30 min à 12000 rpm et
à 4°C. L'activité lipasique est
récupérée puis mesurée dans le surnageant sur la
Tributyrine (TC4) dans les conditions optimales. Le protocole
expérimental de purification de la lipase digestive de crabe (LDC)
comporte les étapes suivantes.
1- Traitement à
60°C
Le surnageant récupéré après
centrifugation contenant 1500 UT, subit un traitement thermique à
60°C pendant 10 min. La solution lipasique est alors centrifugée
pendant 30 min à 12000 rpm et à 4°C. Le surnageant obtenu,
contenant 80 % de l'activité de départ (1200 UT), constitue la
charge de l'étape de chromatographie échangeuse d'anions
(DEAE-cellulose).
2- Chromatographie
échangeuse d'anions
Le surnageant contenant 1200UT est déposé sur
une colonne de DEAE cellulose (20 x 2,5 cm) préalablement
équilibrée dans le tampon A. L'enzyme ne s'adsorbe pas sur la
matrice et il est élué et récupéré dans la
phase de lavage. L'activité totale récupérée
après cette étape est de 800 UT.
3- Précipitation au
sulfate d'ammonium
La préparation enzymatique obtenue subit une
précipitation fractionnée au sulfate d'ammonium entre 30% et 60%
de saturation sous agitation à 4°C. Après 1 heure
d'agitation, le milieu est centrifugé pendant 30 min à 12000 rpm
à 4°C. Le culot est repris dans un minimum de tampon A. La solution
obtenue contenant 500 UT constitue la charge de l'étape de filtration
sur Séphacryl S-200.
4- Filtration sur
Séphacryl S-200
La charge ainsi obtenue est déposée sur une
colonne Séphacryl S-200 (2,5 x150 cm) préalablement
équilibrée dans le tampon A. L'élution des
protéines s'effectue avec le même tampon à un débit
de 30 ml/h. Le profil d'élution, présenté sur la figure 4,
montre que la LDC est éluée entre 1,3 et 1,5 V0.
Figure 4 : Profil d'élution de la LDC
déposée sur une colonne de filtration Séphacryl S-200
équilibrée dans le tampon A. La charge (8 ml) contient 500 UT. Le
débit est de 30 ml/h. Le volume de fraction est de 6 ml.
5- Chromatographie
échangeuse d'anions : Mono Q-Sépharose
Après la filtration sur Séphacryl S-200, les
fractions contenant l'activité lipasique (300 UT) sont
rassemblées et déposées sur une colonne de Mono
Q-Sépharose (3 x 10 cm) équilibrée dans le tampon 20 mM
Tris-HCl, 20 mM NaCl, 2 mM Benzamidine, pH 8 (tampon B). Les protéines
fixées sont éluées avec un gradient linéaire de
NaCl (20 mM à 350 mM). Le débit d'élution est de 45
ml/h.
Le profil d'élution présenté sur la
figure 5, montre que la lipase est éluée à une
concentration de NaCl comprise entre 200 mM et 250 mM.
Figure 5 : Profil d'élution de la LDC
sur une colonne échangeuse d'anions Mono Q-Sépharose. La colonne
(3 x 10 cm) est équilibrée avec le tampon B. Les protéines
retenues sont éluées par 2x100 ml de gradient linéaire de
NaCl (20 mM à 350 mM) dans le tampon B. Le débit est de 45 ml/h.
le volume de fraction est de 3 ml.
| 
