Memoire Online - Production de domaines recombinants PRODH en vue de l'analyse structurale & Caractérisation de la région 51-160 de la protéine KIN17 humaine par RMN et Modélisation Moléculaire

La délimitation du domaine catalytique humain peut être prédite en reportant les éléments de structure secondaire de PutA669 sur l'alignement initial (cf. chapitre 1) mené avec 9 séquences eucaryotes et la séquence de PutA. Sur la base de ce report de structure secondaire, il apparaît que le domaine catalytique humain est situé entre les résidus 270 et 600 (non montré). Cette délimitation est en accord avec les prédictions réalisées par les programmes de threading de type 3D-PSSM, qui confirment l'alignement initial en construisant un modèle par pseudo homologie du domaine catalytique humain qui s'étend des résidus 267 à 570.

Dans l'optique de caractériser l'organisation des domaines de PRODH humaine, nous avons voulu tester la véracité de l'alignement initial en vérifiant l'état de conservation des résidus impliqués dans l'interaction avec le cofacteur ou l'inhibiteur qui sont supposés être fortement conservés. De fortes identités sont effectivement observables au niveau de l'ensemble des feuillets â du tonnelet à l'exception des 2 brins N-terminaux â1 et â2 qui apparaissent non conservés. Ce résultat semble surprenant dans la mesure où 2 résidus du brin

â2 établissent des contacts avec le cofacteur FAD dans la structure de PutA669. Nous avons

soumis les séquences correspondant aux brins â1 et â2 de PutA669 au programme PSI- BLAST afin de déterminer les homologues séquentiels de ces régions. De manière intéressante, les résultats de cette recherche montrent des homologies significatives avec des segments de la région 110-240 de PRODH humaine qui ne sont pas alignés avec la séquence

de PutA sur l'alignement initial (cf. chapitre 1). Le programme PSI-BLAST met également en évidence des homologies avec des fragments N-terminaux de plusieurs séquences de proline déshydrogénase eucaryote qui sont également non alignés avec PutA sur l'alignement initial.

Sur la base de cette analyse, nous avons corrigé l'alignement de séquences qui s'avérait inexact dans la région N-terminale du domaine catalytique. La totalité de ce nouvel alignement de 10 séquences eucaryotes avec PutA669 qui s'étend sur près de 850 résidus est présenté dans la figure 3.2. Cet alignement corrigé fait apparaître 2 insertions au sein du domaine catalytique chez les eucaryotes supérieurs comme le ver Caenorhabditis elegans, la mouche Drosophila Melanogaster, et l'Homme. La première de ces insertions, composée d'une cinquantaine de résidus, est située entre le feuillet â1 et l'hélice á1 du tonnelet á8â8. La seconde, d'une taille deux fois plus importante, est localisée entre le feuillet â2 et l'hélice á2.

Alignement corrigé de 10 séquences de proline déshydrogénase réalisé avec l'aide du logiciel clustalw. Les éléments de structure secondaire reportés sont relatifs à la structure tridimensionnelle du domaine catalytique de PutA669, résolue par diffraction des rayons X (Lee et al., 2003). Les feuillets â sont en vert, et les hélices á en rouge. Les 2 insertions dans

la région N-terminale du domaine catalytique sont mises en évidence. Les résidus sont colorés en rouge lorsqu'ils sont conservés (sigle *), en vert lorsqu'il sont fortement similaires (sigle :), et en bleu lorsqu'ils sont faiblement similaires (sigle .).

CAEEL : proline oxydase de Caenorhabditis elegans (564 résidus) Drosophila : proline oxydase de Drosophila Melanogaster (669 résidus) POMBE : proline oxydase de Schizosaccharomyces pombe (492 résidus) Arabidopsis : proline oxydase de Arabidopsis thaliana (499 résidus)

Tabacum	:	proline oxydase de Nicotiana tabacum (493 résidus)
Oryza	:	proline oxydase de Oryza sativa (475 résidus)
Cerevisiae	:	proline oxydase de Saccharomyces cerevisiae (476 résidus)
Emericella	:	proline oxydase de Emericella nidulans (478 résidus)
PutA	:	proline dehydrogenase de E.coli (648 premiers résidus)

Drosophila 1-----------------MALLRSLSAQRTAISLVYGRNSSKSSNSVAVAACRSFHQRGNG POMBE 1----------------MRAFRLASGVLRNRKVILGIGAGSLITAG---------NIKIRN Arabidopsis 1----------------MATRLLRTNFIRRSYRLPAFSPVGPPTVTAS-------TAVVPE Tabacum 1----------------MANKVVCPKAFRDLRSFVRCLNTAPTVPPMN-------FTGAYD Oryza 1-------------------MAIASRIQKRVLASFAAAAAAKLPEAA--------VAAAGG Cerevisiae 1----------------MIASKSSLLVTKSRIPSLCFPLIKRSYVSKT-------PTHSNT Emericella 1--------------MKAATPRPSVRALSSGRSYRTARFVSRTSNAR--------SSLAAD PutA 1-MGTTTMGVKLDDATRERIKSAATRIDRTPHWLIKQAIFSYLEQLENSDTLPELPALLSG

Human 34-PAAVPGGGSAT------------A---------------------VRP-----------PVPA---------VD-FGNAQ-------------------- CAEEL -T-------------------------------------------III-------------------------E-F------------------------ Drosophila STSIAGEGAASESTRGVNGARFLHSGDRPLQASTLVQPEVVSSETVKRSMKQESSQEKNPSPAGSPQRDPLDVS-FNDPI-------------------- POMBE DSKFDAFFAKG----------------------------------------------------------------FPD---------------------- Arabidopsis ILSFGQQAPEPP---------------------------------LHHP---------KPTEQSHDG-----LD-LSDQA-------------------- Tabacum ATTVTTPALIP-----------------------------------TD----------QVITADKKV-----IN-FEDVK-------------------- Oryza AAEAVEEVASS----------------------------------VQEQ-----------VQAQG----AQVLE-FGDTE-------------------- Cerevisiae AANLMVETPAAN----------------------------------------------------------------ANGN-------------------- Emericella TNSLLQQAPPS--------------------------------------------------------------P-KKQLA-------------------- PutA 60-AANESDEAPTPAEEPHQPFLDFAEQILPQSVSRAAITAAYRRPETEAVSMLLEQARLPQPVAEQAHKLAYQLADKLRNQKNASGRAGMVQGLLQEFSLSS

Human 60---------------EAYRSRRTWELAR---------------SLLVLRLCAWPALLARHEQLLY--V-----SRKLLGQRLFNKLMK------MTFYGH CAEEL ----------------FQSKSNTELVR---------------ALVVLRLCGIQTLVNQNQIILN--T-----MRRVLGKNLFKKTLK------NTFFGH Drosophila --------------AAFKSKTTGELIR---------------AYLVYMICSSENLVEHNMTLMK--W-----SKNVLGQRLFTLLMK------ATFYGH POMBE ---------------ELQHRSLFSVLR---------------SAFVYEICSRAWLVKLSLGAMS--L-----CDVFHLSFLYNPFCR------YTFYKH Arabidopsis --------------RLFSSIPTSDLLR---------------STAVLHAAAIGPMVDLGTWVMSSKL-----MDASVTRGMVLGLVK------STFYDH Tabacum --------------ELFTGVSTLKLIR---------------STLTLQMAATEPMVDVGIWVMNSKL-----MHMPIVKEVILGFVK------GTFYEH Oryza --------------RLFAGERSTSLVR---------------TLAVLQALSVGPLVDVATAALR--------SPAVAGSAAGRAAAR------ATAYQH Cerevisiae --------------SVMAPPNSINFLQT-------------LPKKELFQLGFIGIATLNSFFLN--------TIIKLFPYIPIPVIK------FFVSSL Emericella --------------SPLAKLPLSSVLR---------------SLLILSVSSSSILLKPCIYTLSALAHPKTALLDVAKNPLLNLLVK------HTIYKQ PutA 160-QEGVALMCLAEALLRIPDKATRDALIRDKISNGNWQSHIGRSPSLFVNAATWGLLFTGKLVSTHNEASLSRSLNRIIGKSGEPLIRKGVDMAMRLMGEQ

Human 117-FVAGEDQ-ESIQPLLRHYRAFGVSA-ILDYGVEEDLSPEEAEHKEMES----------CTSAAERDGSGTNKRDKQYQAHRAFGDRRNGVISARTYFYAN CAEEL FVAGETE-EEVRHVVEKLRNYGVKS-ILDYSVEADITSQEATDKTVKGTSVATVKPAAMTPVVDAKTLETTR--ERYTVHEEFGDRRQGVSSARTYFYEG Drosophila FVAGEDQ-IKIIPTLERLRSFGVKP-ILDYSVEEDITQEEAEKREVESS---------VSSAGDKKEEGSMP---QYHVDKSFADRRYKVSSARTYFYLN POMBE FCGGETP-QAVMATMDTLQAAGITS-CLNYSREVDLDGDMDVNKIAS--------------------QG-------------------VVPPQVPVPSEK Arabidopsis FCAGEDADAAAERVRSVYEATGLKG-MLVYGVEHAD---------------------------------------------------------------D Tabacum FCAGKDL-IEVRRTVTKLSDVGLKG-MLDYGVEHAT---------------------------------------------------------------E Oryza FCAGETAEEAAAAVRRLWRG-GMGG-ILDYGIEDAE---------------------------------------------------------------D Cerevisiae YCGGENF-KEVIECGKRLQKRGISNMMLSLTIENSEGTKSLSSTP------------------------------------------------VDQIVKE Emericella FNAGENK-LEVQRSINAIKELGYRGVLLGYAREVLVGESKTDPR-------------------------------------------------------D PutA 259-FVTGETI-AEALANARKLEEKGFRY-SYDMLGEAAL---------------------------------------------------------------T

Human 205-EAKCDSHME--TFLRCIEA--SGRVSDDGF----IAIKLTALGRPQFLLQFSEVLAKWRCFFHQMAVEQGQAGLAAMDTKLEVAVLQESVAKLG-IASRA CAEEL EEQCDKNRD--IFKDSINAV-ASATKNEGF----VAVKITALGRPQLLLKLSEAIVQTQNFFKALTGGMS-----LQEGRLTSQEFYKRLGELGVKTDTE Drosophila EATCERNME--IFIKCLEAV-SGATFGTGI----TAIKLTALGRPQLLLQLSEVIMRTRKYMEDMVGGQGN----VLTHHKTIKDLEKYYATLG---DNK POMBE NQKVLRQIADKAFESNMHIIDMATYKPGTV----CAVKLTPFINPLVLQRYNSILN-------------------------------------------- Arabidopsis AVSCDDNMQ--QFIRTIEAAKSLPTSHFSS----VVVKITAICPISLLKRVSDLL--------------------------------------------- Tabacum NESCDQSMK--VFLQTAESTKSLPSSSVSF----VVVKITAICTPKLLKRMSDLL--------------------------------------------- Oryza GPACDRNAA--GFLAAIDVAAALPPGSAS-----VCIKITALCPVALLEKASDLL--------------------------------------------- Cerevisiae TISSVHNILLPNIIGQLESK-PINDIAPGY----IALKPSALVDNP-----HEVLY-------------------------------------------- Emericella EQASRQEIQ--TWLDGTLQT-VDMAQEGDF----VALKFTGMGI--------QAL--------------------------------------------- PutA 294-AADAQAYMV--SYQQAIHAIGKASNGRGIYEGPGISIKLSALHP--------------------------------------------------------

^{Human
296-EIEDWFTAETLGVSGTMDLLDWSSLIDSRTKLSKHLVVPNAQTGQLEPLLSRFTEEEELQMTRMLQRMDVLAKKATEMGVRLMV---DAEQTYFQP-AIS}

CAEEL SVKKFFDEVDFDSDGIVDLHGWNHILDDHVKLGQLFQVLNIKTGSLEPLIQNLSNEEEQEFRNMVRRTLDVAEYAIEKGVRIMV---DAEQTYLQP-AIS Drosophila DVKEFLNNVTSDKEGILHLFPWSGIVDEDSQLSDTFRVPDPQTGQMRRLISQIPPKEEEMFRNMIRRLNTIVKAAADLDVRIMV---DAEQTYFQP-AIS POMBE ---QYP-------------------VESACNYLEHLK---------SP--E-LSTYEVSELKKFWEYADKLCQFAKEKQIPLFI---DAEQTYFQD-CMH Arabidopsis ---RWEYKSPNFK------LSWK--LKSFPVFSESSPLYHTNS---EP--EPLTAEEERELEAAHGRIQEICRKCQESNVPLLI---DAEDTILQP-AID Tabacum ---RWEHKNPSFN------LPWK--QKSLPLFSDSSPFYHTPQ---KP--EPLTVEEEHDLQLAHERLMTICKKCLELDVDLLI---DAEDTAIQP-AID Oryza ---RWQQKHPATK------LPWK--VHGFPVLCVSSPLYLTAA---EP--PALEAEEERELEMAHGRLLAIGERCAEYDIPLLV---DAEYATVQP-AID Cerevisiae ---NFSN----------------------PAYKAQ------------R--DQLIENCSKITKEIFELNQSLLKKYPERKAPFMVSTIDAEKYDLQENGVY Emericella ---EYL------------------------------------------------QNQAPPSPFMDEAIKQVCDLAISRNVRLLV---DAEEQAVQP-GIE PutA 336----RYS-------------R----------------------------------AQYDRVMEELYPRLKSLTLLARQYDIGINI---DAEEADRLEISLD

Human 392-RLTLEMQRKFNVEKP---LIFNTYQCYLKDAYDNVTLDVELARREGWCFGAKLVRGAYLAQERAR-AAEIGYEDPINPTYEATNAMYHRCLDYVLEELKH CAEEL KITIEMMKKYNKGRG---NIFNTYQAYLKGTLQNMEADMQVARREGWHFGAKLVRGAYMEQERAR-AKAIGYEDPINDNFEATSKMYESCLTRIADEVHR Drosophila RITLEMMRKYNKDKA---IVFNTYQCYLRETFREVNTDLEQAKRQNFYFGAKLVRGAYMDQERDR-AKSLGYPDPVNPTFEATTDMYHRTLSECLRRIKL POMBE AVTVDLMRKYNKEVA---IVHNTYQLYLKKSRKIMDDHIKKCVAEGWLMGAKLVRGAYLNSEPRF-LIHDTKAETDKDFDSAVEAIIAAAAKFAPGDPAS Arabidopsis YMAYSSAIMFNADKDR-PIVYNTIQAYLRDAGERLHLAVQNAEKENVPMGFKLVRGAYMSSEASL-ADSLGCKSPVHDTIQDTHSCYNDCMTFLMEKASN Tabacum YFAYSAAIKYHKDDD--PMIFGTIQAYLKDSKERMVIAKKAAEKMGVPMGFKLVRGAYMSSEREL-ASRLGVQSPIHDSIEQTHDCFNSCAEFMLDEISN Oryza YFTFAGALAFNGGGR--PIVHGTVQAYLRDARDRLEAMARAAQGERVCLALKLVRGAYLAREARL-AASLGVPSPVHRSIQDTHDCYNGCAAFLLDRVRR Cerevisiae ELQRILFQKFNPTSSKLISCVGTWQLYLRDSGDHILHELKLAQENGYKLGLKLVRGAYIHSEKNRNQIIFGDKTGTDENYDRIITQVVNDLIINGEDSYF Emericella EWATMYQKYCNSRTPGRAIFYNTYQAYLCSTPATLARHLEISRKEGYTLGVKLVRGAYLKTEPRH-LIWAKKEQTDECYDGIVEALLTRRYNHMLKPASA PutA 383-LLEKLCFEPELAGWN---GIGFVIQAYQKRCPLVIDYLIDLATRSRRRLMIRLVKGAYWDSEIKRAQMDGLEGYPVYTRKVYTDVSYLACAKKLLAVPNL

Human 488-N--------AKAKVMVASHNEDTVRFALRRMEELG-LHPADHR-VYFGQLLGMCDQISFPLGQ-------------AGYPVYKYVPYGPVMEVLPYLSRR CAEEL R------GKTNVSVMVASHNEDTVRFALNLMKEKC-ISPSERV-MCMAQLYGMCDQVSFSLGQ-------------AGFSVYKYLPYGPVEEVLPYLSRR Drosophila MKDCDD-DARKIGIMVASHNEDTVRFAIQQMKEIG-ISPEDKV-ICFGQLLGMCDYITFPLGQ-------------AGYSAYKYIPYGPVEEVLPYLSRR POMBE ASDPIASRKGKWGIMVASHNKKTMFESVNLAETKK--VDFTKTSFYLAQLLGMADDITYALAYS-------QRNQQPNFCIVKYVSCGPISEVLPYLVRR Arabidopsis GSGF--------GVVLATHNADSGRLASRKASDLG-IDKQNGK-IEFAQLYGMSDALSFGLKR-------------AGFNVSKYMPFGPVATAIPYLLRR Tabacum GSG---------AVVLATHNIDSGKLAASKAIDLG-IRKDSQK-LQFAQLYGMAEGLSFGLRN-------------AGFQVSKYLPFGPVEQVMPYLIRR Oryza GAA---------AVTLATHNVESGQLAAARALELG-IGGGGDRGLQFAQLMGMADGLSLGLRN-------------AGFQVSKYLPYGPVEQIIPYLIRR Cerevisiae G-----------HLVVASHNYQSQMLVTNLLKSTQ-DNSYAKSNIVLGQLLGMADNVTYDLITN-----------HGAKNIIKYVPWGPPLETKDYLLRR Emericella EHTT---ELPPVSVIVATHNRDSVRKAHALRLEQASRGEKSDVELTYAQLQGMADEISCELLQGFQTAGPENTKVAESPNVYKLLTWGSVKECMGFLLRR PutA 480-IYP-----------QFATHNAHTLAAIYQLAGQNY----YP-GQYEFQCLHGMGEPLYEQVTGKVADG-------KLNRPCRIYAPVGTHETLLAYLVRR

Human 565-ALENSSLMKGT--HRERQLLWLELLRRLRTGNLFHRPA-600 // CAEEL ALENGSVLKKA--NKERDLLWKELKRRISSGEFKARSSSSS-564 //

Drosophila AQENKGVLKKI--KKEKRLLLSEIRRRLMRGQLFYKPKGNYVPI-669 // POMBE ARENIDALDRC--KEERAYYRQALRRRIF-492 //

Arabidopsis AYENRGMMATG--AHDRQLMRMELKRRLIAGIA-499 // Tabacum AEENRGLLSTS--AFDRQLMRKELTRRFKVATS-493 // Oryza AEENRGLLSSS--SFDRQLLR-475 //

Cerevisiae LQENGDAVR----SDNGWPLIKAIAKSIPKRVGL-476 // Emericella AVENTEAVGRT--KQSQEAMFSELRRRARRAFGLRY-478 //

PutA 557-LLENGANTSFVNRIADTSLPLDELVADPVTAVEKLAQQEGQTGLPHPKIPLPRDLYGHGRDNSAGLDLANEHRLASLSSALLNSALQKWQAL-648 ...............

Notre alignement corrigé met ainsi en évidence la présence de domaines entremêlés

chez PRODH humaine, et permet de prédire que les segments qui constituent le domaine catalytique humain sont situés dans les régions 113-150, 204-240, et 346-571. Les prédictions

de structure secondaire réalisées sur la séquence humaine sont globalement en accord avec le report des éléments de structure secondaire de PutA669 sur le nouvel alignement, et notamment au niveau des brins supposés â1 (139-144) et â2 (231-233) de PRODH humaine

qui sont effectivement prédits en feuillet. Cette analyse confirme ainsi l'exactitude de notre alignement comparé à l'alignement initial.

Les prédictions de structure secondaire suggèrent une structuration des 2 insertions,

qui apparaissent dans le domaine catalytique, en hélice á. Sur notre alignement corrigé, ces 2 insertions sont respectivement localisées sur la séquence de PutA autour des résidus L292 pour la première, et R336 pour la seconde (Figure 3.2). De manière intéressante, ces 2 résidus appartiennent à des boucles situées sur une même surface exposée au solvant de la structure tridimensionnelle de PutA669 (Figure 3.3). Cette caractéristique structurale laisse supposer que ces 2 insertions pourraient former un domaine unique entremêlé à la périphérie du tonnelet á8â8 chez les eucaryotes supérieurs.

Figure 3.3 : Mise en évidence des 2 sites d'insertion sur la structure du tonnelet á8â8 de PutA669. Les éléments de structure secondaire et les molécules de FAD et lactate sont colorés comme dans la figure précédente. Les résidus L292 et R336 sont représentés par des sticks. Les atomes d'azote sont colorés en bleu, et d'oxygène en rose.

Outre les 2 insertions, l'alignement de la Figure 3.2 fait également apparaître une région N-terminale non conservée de la bactérie à l'homme dans l'extrémité 1-112 de PRODH humaine. Cette région, de fonction inconnue et uniquement conservée chez les

eucaryotes supérieurs, semble structurée au vu des prédictions de structure secondaire, et du

nombre de résidus hydrophobes qu'elle comporte. Par conséquent, elle pourrait contenir un domaine de repliement autonome indépendant du domaine catalytique et des 2 insertions.

Production de domaines recombinants PRODH en vue de l'analyse structurale & Caractérisation de la région 51-160 de la protéine KIN17 humaine par RMN et Modélisation Moléculaire

2) Caractérisation de l'organisation de PRODH humaine

2.1) Report de la structure secondaire de PutA669 sur l'alignement initial