3) Sélection des 3 domaines à
exprimer
Lorsque nous avons entrepris l'étude structurale
de PRODH humaine, nous avions envisagé une stratégie qui
consiste à isoler des domaines structurés de PRODH par digestion
enzymatique à partir de la protéine sauvage repliée, puis
à résoudre par RMN la structure de ceux dont la taille est
compatible avec une telle étude. A présent, nous avons
montré à partir
de la connaissance de la structure de
l'hétérologue bactérien PutA669 que le domaine
catalytique humain est très probablement constitué d'un tonnelet
á8â8 de près de 350 résidus. Nous avons
également mis en évidence la présence d'un ou deux
domaines entremêlés dans
ce domaine catalytique (Figure 3.4). Sur la base de
ces prédictions, il est clair que la caractérisation
structurale du domaine catalytique humain n'est envisageable que par
la résolution de structure de la large région 113-571 de
PRODH humaine qui comporte le domaine catalytique et les 2 insertions.
Aussi, l'étude structurale d'une telle région de 59 kDa
n'est pas réalisable par RMN.
domaine
PS N-terminal
1ère
insertion
2ème
insertion
domaine catalytique
1 36 113 151 203 241 345 600
Figure 3.4 : Prédiction
des domaines potentiels de la proline déshydrogénase
humaine à
partir du bilan consensus de l'ensemble des
analyses bio-informatiques. Le sigle PS
correspond à « peptide signal ».
La Figure 3.4 résume la prédiction des
domaines potentiels de PRODH humaine réalisée à partir
de l'ensemble des analyses bio-informatiques. Ces prédictions
suggèrent que
la proline déshydrogénase humaine comporte :
un peptide signal d'adressage mitochondrial
(1-36), une région N-terminale hydrophobe (37-112), et un
large domaine catalytique (113-
600) entremêlé avec 2 insertions de
respectivement 52 et 104 résidus (151-203 et 241-345). Sur la base de
cette analyse bio-informatique, nous avons décidé de modifier
notre stratégie d'étude structurale initialement définie,
et de sélectionner 3 domaines de PRODH humaine à
exprimer. En effet, au-delà du domaine catalytique, il
serait intéressant de connaître les rôles
structural et fonctionnel de la région N-terminale
hydrophobe et de chacune des 2 insertions. Cependant, la résolution de
structure du domaine catalytique n'en demeure pas moins un de nos objectifs
dans l'optique de caractériser son mode d'action chez les organismes
eucaryotes. C'est pourquoi, nous avons sélectionné 3
régions de PRODH humaine afin de les soumettre
au programme de production de protéines du LMP.
Ces 3 domaines protéiques sont les suivants :
- PROcatal (59 kDa) : région
115-600 de PRODH qui comporte le domaine catalytique
prédit et les 2 insertions potentielles.
- PROinser (16 kDa) : région
239-353 de PRODH qui correspond à la seconde
insertion.
- PROter (13 kDa) : région
39-125 de PRODH qui comporte le domaine N-terminal
potentiel délestée du peptide signal.
La délimitation de ces 3 régions a
été réalisée en utilisant les diagrammes de
prédiction de structure secondaire, et de visualisation des amas
de résidus hydrophobes (analyse HCA). Pour chaque domaine, la
démarche a consisté à choisir le premier et le dernier
résidu situés entre 2 éléments de structure
secondaire prédits, et d'éviter que ces résidus soient
hydrophobes, afin de limiter le risque d'agrégation lors de la
surexpression chez E. coli. D'autre part, ayant conscience que
la sélection de domaines à partir d'une analyse bio-
informatique présente un caractère spéculatif, nous avons
également entrepris de produire la forme mature de PRODH dans le cadre
du programme de la plate-forme du LMP. Le choix du premier résidu de ce
domaine a également été guidé en se basant sur le
diagramme HCA et les prédictions de structure secondaire. Cette
construction est nommée :
- PROentier (68 kDa) : région
39-600 de PRODH qui correspond à la
protéine entière délestée du peptide signal
potentiel.
Dans le cas où ces 4 protéines seraient
exprimées sous forme soluble, les domaines de faible masse
moléculaire PROinser et PROter seraient étudiés en
solution par RMN, alors que
les protéines PROcatal et PROentier, de poids
moléculaire supérieur ou égal à 59 kDa,
seraient plutôt destinées à une étude de
croissance cristalline dans l'optique de résoudre la structure par
radiocristallographie. Il serait également possible d'entreprendre une
digestion enzymatique des protéines PROcatal et PROentier
repliées afin d'isoler des domaines
structuraux de faible taille qui pourraient alors être
étudiés par RMN.
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