CHAPITRE 4
Expression de 4 protéines PRODH dans le
cadre d'un programme de production
L'expression des protéines PRODH sauvage et mature
chez E. coli conduisant à
l'unique formation de corps d'inclusion, nous
avons modifié notre stratégie d'étude structurale
initialement définie. Sur la base de nouvelles données apparues
dans la littérature, nous avons sélectionné 3 domaines
PRODH humains (PROcatal, PROter, et PROinser) à partir d'une
étude bio-informatique. L'expression sous forme soluble
constituant l'étape limitante de la stratégie, nous avons
choisi de produire ces 3 domaines, ainsi que la forme mature de PRODH
(rebaptisée PROentier), dans le cadre du programme de production 3PM
du LMP du CEA de Saclay, dédié à la
surexpression de protéines solubles chez E. coli. Avant
de présenter les résultats de ce travail qui a
été mené sous la direction des Dr. Sandrine Braud
et Muriel Gondry, la stratégie de production des 4
protéines PRODH dans le cadre d'une telle structure sera
exposée.
1) Stratégie de production des 4
protéines PRODH
1.1) Stratégie générale
Parmi les différents hôtes d'expression
disponibles, la bactérie Escherichia coli est
généralement choisie pour sa facilité d'utilisation, sa
croissance rapide, sa génétique simple, son faible coût de
production, et ses taux d'expression élevés. De plus, dans
l'optique d'une caractérisation par RMN, il existe des milieux enrichis
en isotopes 15N et 13C qui permettent
de produire des protéines marquées avec des taux
d'expression tout aussi élevés. Cependant,
l'expression chez E. coli présente
des inconvénients majeurs, comme l'absence de modifications
post-traductionnelles, l'instabilité des ARNm, et la
différence d'usage de codons avec les espèces eucaryotes.
Ces inconvénients peuvent compromettre la qualité de
l'expression en favorisant l'apparition de corps d'inclusion, comme
nous l'avons constaté avec les protéines PRODH sauvage et
mature.
Au cours de ces dernières années, il a
été montré que la formation de corps d'inclusion,
inhérente à l'utilisation de l'hôte bactérien E.
coli, peut être limitée en exprimant
les gènes d'intérêt en fusion avec
un partenaire protéique fortement soluble (Kapust & Waugh,
1999). Les mécanismes avec lesquels ces partenaires favorisent
le repliement des protéines d'intérêt sont à ce
jour encore peu connus. Aussi, une récente étude comparative
des
7 partenaires décrits comme les plus efficaces a mis en
évidence qu'il n'existe aucune « règle
universelle » permettant de prévoir l'effet d'un
partenaire de fusion sur la solubilité d'une
protéine (Hammarström et al., 2002). En d'autres
termes, certains partenaires qui se montrent très efficaces pour
certaines protéines, se révèlent médiocres pour
d'autres. Par conséquent, le criblage du plus grand nombre d'entre eux
semble être la méthode qui offre le plus de chance d'obtenir une
protéine de fusion exprimée sous forme soluble (Vincentelli et
al., 2003).
Outre le partenaire de fusion, d'autres paramètres
comme la souche bactérienne d'E. coli peuvent influencer
l'expression et la solubilité des protéines recombinantes.
Les grandes avancées dans le domaine du génie
génétique, observées au cours de ces dernières
années, ont abouti à l'émergence de nouvelles
souches qui présentent des caractéristiques
intéressantes dans l'optique de produire des protéines
hétérogènes eucaryotes (stabilité accrue des ARNm,
présence d'ARNt correspondant à des codons rares chez E.
coli, surproduction de
membranes, etc.) (Lopez et al., 1999 ; Jonasson et al., 2002).
Sur la base de ces études récentes, il
nous est apparu intéressant d'intégrer une structure qui
permette de tester l'expression des 4 protéines PRODH en fusion avec
différents partenaires et dans plusieurs souches
bactériennes. C'est pourquoi, nous avons entrepris de produire
ces 4 protéines dans le cadre du Programme de Production et
Marquage des Protéines 3PM du LMP (Braud et al., 2005). Pour pallier la
formation des corps d'inclusion,
la plate-forme 3PM propose un criblage systématique de
plusieurs conditions expérimentales
(7 partenaires de fusion, 3 souches d'expression, et 2
températures d'expression) afin de déterminer les
meilleures conditions d'expression relatives à chaque
protéine testée. Cependant, le criblage d'un grand nombre de
conditions ne peut être réalisé dans un temps raisonnable
sans recourir à une miniaturisation et un traitement en parallèle
des échantillons.
Par conséquent, le processus d'expression des
protéines se déroule en 2 étapes distinctes :
- Une première étape de criblage des conditions
d'expression réalisée à petite échelle sur
microplaques en volume de 250 uL.
- Puis, une fois les meilleures conditions d'expression de
protéine soluble déterminées, une production à
grande échelle pour obtenir les protéines en quantité
appréciable.
Outre la possibilité de tester un grand nombre de
conditions, ce processus d'expression offre également l'avantage de
pouvoir produire plusieurs domaines simultanément, ce qui est
difficilement réalisable avec des techniques d'expression
classiques. La stratégie de
production de protéines solubles dans le cadre du
programme 3PM peut se décomposer en
trois principales phases que je vais brièvement
présenter dans les prochains paragraphes.
| 
