Production de domaines recombinants PRODH en vue de l'analyse structurale & Caractérisation de la région 51-160 de la protéine KIN17 humaine par RMN et Modélisation Moléculaire

CHAPITRE 3

Stratégie d'étude par RMN et Modélisation

Moléculaire du domaine K2

La radiocristallographie et la Résonance Magnétique Nucléaire sont à ce jour les deux

techniques qui permettent d'obtenir la structure 3D d'une protéine à l'échelle atomique. Comparée à la RMN, les avantages principaux de la radiocristallographie sont d'une part, la précision de l'information obtenue et d'autre part, l'accès à des masses moléculaires élevées

(> 200 kDa). Il en découle que la grande majorité des structures publiées sont résolues par cette technique moins restreinte, et souvent moins coûteuse en terme de temps d'interprétation des données. La spectroscopie de RMN n'est donc, à priori, pas la méthode de choix pour déterminer la structure tridimensionnelle d'une protéine. Cependant, elle est le seul recours lorsque l'obtention d'un monocristal ou la détermination des phases est impossible. Sa principale qualité se situe dans l'étude des dynamiques moléculaires et d'interactions entre les molécules, étape clef de l'exploration des relations structure activité. Ces quinze dernières années ont fait l'objet d'importants développements techniques et méthodologiques qui rendent

la spectroscopie de RMN plus efficace dans la résolution de structures macromoléculaires. Ces progrès ont notamment visé à améliorer la résolution et la sensibilité de la technique.

La fréquence de résonance du proton, qui traduit l'intensité des aimants supraconducteurs, peut atteindre à présent jusqu'à 950 MHz. L'augmentation de résolution qui

en découle a été accompagnée par l'apparition de sondes de mesure, à une température proche

de celle de l'hélium liquide (cryosondes), qui offrent un gain de sensibilité d'un facteur 2 à 4

comparée aux sondes classiques. Ces grandes avancées technologiques n'auraient cependant

pas été suffisantes sans le développement, de séquences RMN 3D et 4D (Marion et al., 1989 ; Clore & Gronenborn, 1991), et de méthodes de marquage(s) isotopique(s) des noyaux ¹⁵N, ¹³C,

et ²D (Redfield et al., 1989 ; Xu et al., 1999), qui permettent l'étude structurale de

biomolécules de taille de plus en plus importante. Parmi ces progrès méthodologiques, figure notamment la spectroscopie TROSY (Transverse Relaxation Optimized spectroscopY) (Pervushin et al., 1997) utilisée à hauts champs pour des protéines de masse supérieure à

20 kDa, et dont la combinaison à un marquage au deutérium ²D, apporte un gain considérable

en résolution et en sensibilité. En amont du calcul de la structure, l'émergence de programmes d'attribution automatique ou semi-automatique, des résonances (Zimmerman et al., 1997), ou

des pics nOe (Nilges et al., 1997), rend la collecte des contraintes structurales RMN moins lourde, et donc moins coûteuse en temps. L'application de l'ensemble de ces développements permet aujourd'hui de trouver dans la littérature des reports d'attribution de protéines de plus

de 80 kDa (Tugarinov et al., 2004), ainsi que des structures tridimensionnelles de protéine de

48 kDa résolues par RMN (Williams et al., 2005). Cela étant, pour des protéines de cette taille,

les moyens employés en termes de production d'échantillons (nécessité de différents marquages spécifiques et onéreux), temps d'enregistrement des expériences, et temps d'interprétation des données, deviennent alors considérables.

Stratégie générale de l'étude structurale de K2 par RMN et Modélisation Moléculaire

La stratégie adoptée pour caractériser la structure d'une protéine par spectroscopie de

RMN et Modélisation Moléculaire dépend de sa masse moléculaire, ainsi que des outils d'analyse et de traitement à disposition du structuraliste. Le domaine K2 de KIN17 est une protéine de 111 acides aminés, que l'on peut qualifier de taille moyenne pour une étude par RMN. Les différentes étapes de la méthodologie employée pour résoudre la structure de K2 sont schématisées en Figure 3.1, et sont détaillées dans ce chapitre.

Préparation des échantillons

de protéine marquée ¹⁵N, et

¹⁵N / ¹³C

Attribution des raies de résonance de la protéine

Détermination de la topologie

- chaîne principale

- chaînes latérales

- déplacements chimiques

- nOe ¹H-¹H caractéristiques des structures secondaires

- constantes de couplage ³JHN-Há

- nOe hétéronucléaire ¹H-¹⁵N

- vitesses d'échange ¹H-²D

Calcul de la structure par Modélisation

Moléculaire sous contraintes RMN

- attribution automatique des nOe

- dynamique moléculaire sous CNS

Recueil des contraintes structurales

- nOe ¹H-¹H

- angles dièdres et

- liaisons hydrogène

Structure 3D

Figure 3.1 : Résumé des principales étapes de la stratégie d'étude structurale du domaine K2

1) Méthode d'attribution des raies de résonance

Après avoir préparé un échantillon de protéine pur, concentré, et stable, l'enregistrement des expériences RMN peut débuter. Les informations et contraintes structurales ne peuvent être directement extraites des spectres RMN. Il est tout d'abord nécessaire de déterminer les déplacements chimiques de chacun des atomes de la biomolécule. Le choix de la stratégie à employer pour attribuer les raies de résonance est dicté par la taille de la protéine étudiée. Pour une protéine de 111 résidus comme le domaine K2, l'attribution peut être menée par

deux méthodes distinctes qui dépendent du type de marquage isotopique de l'échantillon.

La première de celles-ci est basée sur l'enregistrement d'expériences 3D hétéronucléaires de type ¹⁵N-TOCSY-HSQC et ¹⁵N-NOESY-HSQC. L'attribution des résonances ¹H et ¹⁵N est alors réalisée selon la stratégie décrite dans l'ouvrage de Wüthrich (Wüthrich, 1986) qui repose sur les couplages homonucléaires scalaire et dipolaire ¹H-¹H. Cette méthode est généralement applicable à des protéines contenant jusqu'à 130 acides aminés, et présente l'avantage de ne nécessiter qu'un simple marquage ¹⁵N. Toutefois, pour

des polypeptides de cette taille, qui adoptent une structure tertiaire, ce type de stratégie basée

sur l'identification du nOe présente un caractère ambigu. De plus, dès 100 résidus, l'augmentation de la taille peut conduire à une réduction de l'efficacité du transfert TOCSY

¹H-¹H, qui engendre une diminution du nombre de résonances, et notamment dans les régions

structurées en hélice où les constantes de couplage ³JHN-Há sont faibles. C'est le cas de la protéine K2 où la quantité d'information recueillie sur le spectre ¹⁵N-TOCSY-HSQC est insuffisante pour envisager l'attribution complète des fréquences ¹H et ¹⁵N par cette stratégie.

Il existe pour les protéines doublement marquées ¹⁵N / ¹³C une attribution séquentielle alternative basée uniquement sur des transferts de cohérence via les couplages scalaires homonucléaires et hétéronucléaires. La méthode repose sur l'enregistrement d'une combinaison d'expériences 3D hétéronucléaires de double ou triple résonance qui corrèlent chacune 2 ou 3 types de noyaux différents. Cette stratégie, utilisée pour attribuer l'ensemble des résonances de la chaîne principale de la protéine K2, est présentée dans le paragraphe

suivant.

^{1.1) Attribution des carbones de la chaîne principale et des 13C}â

1.1.1) Stratégie générale

Les expériences 3D de triple résonance utilisées classiquement pour l'attribution du squelette d'une protéine doublement marquée sont, pour la plupart d'entre elles, basées sur le même principe : la corrélation du proton amide d'un résidu i avec respectivement, l'azote qui

le porte, et un carbone Ci (CO, Cá, ou Câ) du résidu précédent et/ou du même résidu. Ces corrélations, dépendant du chemin de cohérence sélectionné, se font par le transfert successif

de l'aimantation à travers plusieurs liaisons covalentes via des couplages scalaires ^1,2J

relativement élevés (¹JC-C, ¹JC-N, ¹JH-N, ¹JH-C, ²JC-N, et ²JC-C). Les six expériences 3D couramment utilisées pour l'attribution complète des noyaux ¹HN, ¹⁵N, ¹³CO, ¹³Cá, et ¹³Câ sont : HNCA, HN(CO)CA, HNCO, HN(CA)CO, CBCANH, et CBCA(CO)NH (Pour revues : Cavanagh et al., 1996 ; Sattler et al., 1999 ; Kanelis et al., 2001). Le nom de ces expériences indique les noyaux qui sont impliqués dans les chemins de cohérence suivis. Les noyaux mis entre parenthèses ne sont pas édités en fréquence et servent uniquement à relayer l'aimantation. On peut classer ces six expériences en deux catégories distinctes :

- La première corrèle le groupement amide du résidu i avec les carbones ¹³C du résidu i-1,

et permet ainsi d'obtenir les déplacements chimiques du triplet (Ni ; HN ; C ).

i i-1

- Dans la seconde catégorie, le groupement amide du résidu i est relié aux carbones ¹³C

du résidu i et du résidu i-1. L'information obtenue est alors double, et les déplacements

chimiques recueillis constituent le quadruplet (Ni ; HN ; C

; C ).

i i-1 i

La combinaison de ces deux types d'expériences peut donc permettre de déterminer

sans ambiguïté les déplacements chimiques des carbones ¹³CO, ¹³Cá, et ¹³Câ des résidus i et

i-1 relatifs à chaque groupement amide. Il est alors possible de connecter les résidus deux à deux en comparant les valeurs de déplacements chimiques Ci des uns aux valeurs de Ci-1 des autres (Figure 3.2). Finalement, le rapprochement de cette attribution séquentielle à la séquence primaire est initié en recherchant les acides aminés particuliers qui présentent des valeurs de déplacement chimique caractéristiques. C'est le cas de la glycine qui ne possède

pas de Câ, et des résidus thréonine, sérine et alanine, dont les valeurs de déplacement

chimique de Cá et Câ sont spécifiques.

Liste de déplacements chimiques (Ni ; H^Ni ; Ci-1 ; Ci)

C C

^N C ^C N ^{C C}

C C

^{N C C} N ^{C C}

C C

N C C N C C

^{H H O} H H O

^{H H O} H H O

H H O H H O

C

C

C

C

C

C

N

C

C

N

C

C

N

C

C

N

C

C

N

C

C

N

C

C

H

H

O

H

H

O

H

H

O

H

H

O

H

H

O

H

H

O

^C C C

C C C

^{N C C} N

^{C C} N

C C N

^C C N

C C N C C

^{H H O} H

H O H

i

i+6

C

C

C

C

C

C

N

C

C

N

C

C

N

C

C

N

C

C

N

C

C

N

C

C

H

H

O

H

H

O

H

H

O

H

H

O

H

H

O

H

H

O

H O H

H O H

H O H H O

Figure 3.2 : Principe de l'attribution séquentielle basée sur l'enregistrement d'expériences 3D

i

de triple résonance ¹H, ¹⁵N, ¹³C. Chaque groupement amide (H^Ni ; N^H ) est associé aux triplets

de déplacements chimiques (13COi ; 13Cái ; 13Câ ) et (13CO

; 13Cá

; 13Câ

) relatifs aux

i i-1

i-1

i-1

résidus i, et i-1. Les connexions de la séquence peptidique sont retracées résidu par résidu en comparant les valeurs de déplacements chimiques ¹³Ci aux valeurs de ¹³Ci-1 triplet par triplet.

Les valeurs de déplacement chimique des noyaux ¹³CO, ¹³Cá, et ¹³Câ sont respectivement déterminées, par les couples d'expériences HNCO et HN(CA)CO, HNCA et HN(CO)CA, CBCANH et CBCA(CO)NH. Ces expériences s'interprètent par paire et chaque couple fournit un chemin d'attribution potentiel.

1.1.2) Description des expériences 3D triple résonance

Les séquences d'impulsion des expériences 3D de triple résonance utilisées pour l'attribution séquentielle sont toutes du même type : la séquence débute par un transfert de polarisation de type INEPT (Insensitive Nuclei Enhanced by Polarisation Transfert) du proton

¹H vers l'hétéroatome (¹⁵N ou ¹³C) qui le porte (Figure 3.3). L'aimantation évolue ensuite en

fonction de différents couplages scalaires et du déplacement chimique ¹³Ci avant d'être transférée vers le noyau amide ¹⁵NH via le couplage ¹⁵N-¹³Cá ou ¹⁵N-¹³CO. Finalement, un

transfert de polarisation de type INEPT-inverse permet de détecter l'aimantation sur le noyau

amide ¹HN.

J

1

C-H

(130 Hz)

J

1

X-H,

¹³CO

13Cá

1

^1JN-CO

2

^1JN-H ^{(90 Hz)}

^2JX-H^{, ...}

^13Câ

^JN-Cá ^,

^JN-Cá

^1JN-H ^{(90 Hz)}

^1HN/á/â

INEPT

¹⁵NH 13

C

13 ^Ci

á/â

15NH

INEPT-inverse

1HN

(t1) (t2) (t3)

Figure 3.3 : Représentation schématique du transfert de l'aimantation dans une expérience

3D triple résonance de type HNCA, HN(CO)CA, HNCO, HN(CA)CO, CBCANH, ou

CBCA(CO)NH.

a) Attribution des Cá

L'expérience HNCA corrèle le groupement amide au carbone Cá via le couplage scalaire ¹⁵N-¹³Cá. Sur les spectres correspondants, deux pics peuvent apparaître par résidu :

une première corrélation du groupement amide avec le C^ái, et une seconde avec le C^ái-1

(Figure 3.4). Ceci s'explique par les valeurs de constante de couplage ¹JN-Cá (11 Hz) et ²JN-Cá

(-7 Hz) qui sont du même ordre de grandeur. La différence d'intensité des deux pics, due au

fait que |¹JN-Cá| > |²JN-Cá|, pourrait permettre de distinguer le déplacement chimique provenant

du C^ái, de celui du C^ái-1. Il est cependant préférable de vérifier une telle attribution à l'aide de l'expérience HN(CO)CA complémentaire. Celle-ci corrèle le groupement amide au seul carbone Cá-1 en deux étapes via le carbonyle ¹³COi-1 non édité. La différence de constante de couplage ¹JN-CO (15 Hz) et ²JN-CO (1 Hz) permet d'orienter sélectivement l'aimantation vers le

¹³COi-1, puis vers le C^ái-1 via la liaison ¹JCO-Cá (55 Hz).

Ces deux expériences fournissent un premier chemin d'attribution séquentielle et pourraient suffire à connecter tous les résidus deux à deux. Cependant, pour la majorité des acides aminés, les déplacements chimiques de Cá ne sont pas caractéristiques, et ne permettent une attribution sans ambiguïtés. De plus, le recouvrement des pics de corrélation dans les régions encombrées des spectres peut induire une incertitude sur certaines valeurs de

déplacement chimique de Cá.

HN(CO)CA

HNCA

H

O

H

H

O

H

O

H

H

O

A)

C

C

N

C

C

C

C

N

C

C

H

C

H

H

C

H

H

C

H

H

C

H

^13Cá

B)

^CáX-1

^CáY-1

¹⁵N

^13Cá

CáY

^CáX ^CáY-1

^CáX-1

¹⁵N

HX HY

NY

NX

¹HN

HX HY

NY

NX

¹HN

Figure 3.4 : Expériences 3D de triple résonance utilisées pour l'attribution des ¹³Cá d'une protéine. A) Schéma du transfert de l'aimantation dans les expériences HN(CO)CA et HNCA.

Les noyaux édités en fréquence sont indiqués par des cercles noirs, alors que ceux uniquement relayés, sont indiqués par des cercles blancs. B) Exemple illustré de spectres HN(CO)CA et HNCA correspondants à un segment de 2 résidus consécutifs X-Y ; mise en évidence de la connectivité séquentielle.

b) Attribution des CO

Selon le même principe, les expériences HNCO et HN(CA)CO procurent les corrélations entre les résonances ¹HN et ¹⁵NH et les ¹³CO intra- et inter-résidus (Figure 3.5). L'expérience HNCO fournit uniquement une corrélation avec le carbonyle ¹³COi-1 via la constante de couplage ¹JN-CO. La HN(CA)CO utilise les couplages scalaires ¹JN-Cá, ²JN-Cá, et

¹JN-CO pour relier le ¹³COi et le ¹³COi-1 au groupement amide via le noyau (CA) non édité. A

l'instar de l'expérience HNCA, l'intensité du pic inter-résidu est généralement plus faible que celle du pic intra-résidu du fait que |¹JN-Cá| > |²JN-Cá|.

Alors que la HNCO est l'expérience de triple résonance la plus sensible, la HN(CA)CO est la moins sensible. Toutefois, il existe d'autres expériences, comme la (HCA)CO(CAN)NH, qui permettent d'obtenir les corrélations des ¹³CO intra- et inter-résidus,

et qui sont plus sensibles que la HN(CA)CO. Cependant, la quantité d'information présente

sur les spectres n'est pas toujours suffisante pour retracer les connexions de la chaîne

peptidique résidu par résidu. D'autre part, la dispersion des déplacements chimiques des

carbonyles étant faible (de l'ordre de 10 ppm), le risque d'ambiguïtés et de recouvrement spectral en est plus important. Ces deux types d'expériences ne constituent donc pas le couple privilégié permettant l'attribution séquentielle, mais apportent cependant une information supplémentaire pour lever d'éventuelles ambiguïtés.

HNCO

HN(CA)CO

H

O

H

H

O

H

O

H

H

O

A)

C

C

N

C

C

C

C

N

C

C

H

C

H

H

C

H

H

C

H

H

C

H

¹³CO

^COX-1

¹³CO

^COX-1

COY-1

^B)

¹⁵N

^COX

^COY-1

COY

¹⁵N

HX HY

NY

NX

¹HN

HX HY

NY

NX

¹HN

Figure 3.5 : Expériences 3D de triple résonance utilisées pour l'attribution des ¹³CO d'une protéine. A) Schéma du transfert de l'aimantation dans les expériences HNCO et HN(CA)CO. Les noyaux édités en fréquence sont indiqués par des cercles noirs, alors que ceux uniquement relayés, sont indiqués par des cercles blancs. B) Exemple illustré de spectres HNCO et HN(CA)CO correspondants à un segment de 2 résidus consécutifs X-Y ; mise en évidence de la connectivité séquentielle.

c) Attribution des Câ

Les expériences CBCA(CO)NH et CBCANH sont sans aucun doute les expériences majeures dans la stratégie d'attribution. Elles fournissent les mêmes informations que le couple HN(CO)CA et HNCA et de plus, mettent en évidence les corrélations du groupement amide avec les ¹³Câ intra- et inter-résidus (Figure 3.6). Outre l'apport d'une information de fréquence supplémentaire, la connaissance du déplacement chimique du ¹³Câ permet une identification partielle du type de résidu, et de relier les chaînes latérales à l'attribution séquentielle du squelette.

Les deux expériences débutent de la même façon : après transfert de l'aimantation des

protons aliphatiques vers leur carbone, l'aimantation provenant du ¹³Câ est transférée au ¹³Cá

via la constante de couplage ¹JCá-Câ (35 Hz). Elle est ensuite orientée sélectivement vers le

¹⁵NH pour la CBCANH, ou vers le ¹³CO (puis vers le ¹⁵NH) pour la CBCA(CO)NH. Au final, l'expérience CBCANH fait apparaître les corrélations du groupement amide avec les noyaux

¹³Cá et ¹³Câ des résidus i et i-1, et la CBCA(CO)NH procure uniquement les corrélations avec

les noyaux ¹³Cá et ¹³Câ du résidu i.

CBCA(CO)NH

CBCANH

H

O

H

H

O

H

O

H

H

O

A)

C

C

N

C

C

C

C

N

C

C

H

C

H

H

C

H

H

C

H

H

C

H

^13Cá/â

B)

^CâX-1

^CáX-1

HX HY

^CâY-1

^CáY-1

¹HN

15N

NY NX

¹³Cá/â

CâX

^CâX-1

CáX

^CáX-1

HX HY

^CâY

^CâY-1

CáY

^CáY-1

¹HN

15N

NY NX

Figure 3.6 : Expériences 3D de triple résonance utilisées pour l'attribution des ¹³Câ d'une protéine. A) Schéma du transfert de l'aimantation dans les expériences CBCA(CO)NH et CBCANH. Les noyaux édités en fréquence sont indiqués par des cercles noirs, alors que ceux uniquement relayés, sont indiqués par des cercles blancs. B) Exemple illustré de spectres CBCA(CO)NH et CBCANH correspondants à un segment de 2 résidus consécutifs X-Y ; mise

en évidence des connectivités séquentielles.

1.2) Attribution des protons Há et Hâ

Les 3 couples d'expériences décrits précédemment ne sont pas toujours suffisants pour reconstituer l'ensemble de la chaîne peptidique. En effet, certains inconvénients inhérents à l'analyse d'une protéine par RMN comme le recouvrement spectral, et la dégénérescence partielle du signal, nuisent à la qualité et à la quantité d'information présente sur les spectres,

^{et ne permettent généralement pas de relever la totalité des déplacements chimiques 13C}á^,

¹³Câ, et ¹³CO des résidus i et i-1 relatifs à chaque groupement amide. L'attribution

séquentielle peut cependant être complétée et vérifiée à partir du déplacement chimique ¹Há

fournit par les expériences 3D HNHA et HBHA(CO)NH.

L'expérience HNHA (Vuister & Bax, 1993) est classiquement utilisée pour corréler le

groupement amide (1HN ; 15NH ) au seul proton 1Há

intra-résiduel. Cette expérience de double

i i i

résonance ¹H, ¹⁵N ne nécessite qu'un échantillon de protéine simplement marquée ¹⁵N. Cependant, l'intensité des pics observés sur les spectres est proportionnelle à la constante de couplage ³JHN-Há, et pour des valeurs faibles, il est parfois difficile d'observer une tache de corrélation. Cet inconvénient ne se retrouve pas avec l'expérience triple résonance HBHA(CO)NH (Grzesiek & Bax, 1993), qui permet de relier chaque groupement amide aux noyaux ¹Há et ¹Hâ du résidu précédent (Figure 3.7). En effet, cette expérience, plus sensible

que la HNHA, est tout à fait comparable à la CBCA(CO)NH et met en jeu un transfert de

l'aimantation, via des couplages scalaires forts, de la chaîne latérale i-1 au groupement amide

i via le noyau ¹³COi-1 non édité.

La combinaison des expériences HNHA et HBHA(CO)NH permet donc d'identifier le déplacement chimique des protons ¹Há des résidus i et i-1 relatifs à chaque groupement amide, et ainsi de consolider l'attribution séquentielle. Le déplacement chimique des protons

H^âi-1, dont l'ordre de grandeur fournit une indication du type d'acide aminé, peut également

être utilisé pour contrôler l'attribution.

HBHA(CO)NH

^1Há/â

Hâ2i-1

^Hâ1i-1

H O

A) C C

H C H

H H O

N C C B)

H C H

^Hái-1

15N

NHi

HNi

¹HN

Figure 3.7 : Attribution des protons ¹Há et ¹Hâ avec l'expérience 3D de triple résonance HBHA(CO)NH. A) Schéma illustrant le transfert de l'aimantation : les noyaux édités en fréquence sont indiqués par des cercles noirs, et ceux uniquement relayés, sont indiqués par

des cercles blancs. B) Illustration des corrélations observables sur un spectre HBHA(CO)NH

pour un groupement amide i.

1.3) Attribution des chaînes latérales

1.3.1) Description des expériences 3D HCCH-COSY et HCCH-TOCSY

Les expériences utilisées pour l'attribution des chaînes latérales sont généralement des expériences 3D de double résonance ¹H et ¹³C. C'est le cas de la HCCH-COSY, et de la HCCH-TOCSY, qui permettent d'identifier les protons et carbones des chaînes aliphatiques et aromatiques (Kay et al., 1993 ; Majumdar et al., 1993) . Ces deux expériences peuvent être interprétées comme des 2D ¹H-¹H COSY et TOCSY, et la troisième dimension disperse l'information selon la fréquence du carbone ¹³C. Les chemins de cohérence suivis sont

cependant très différents de ceux observés dans des expériences 2D homonucléaires ¹H.

Ainsi, la séquence d'impulsions HCCH-TOCSY contient un motif TOCSY ¹³C-¹³C pendant lequel l'aimantation est transférée le long de la chaîne carbonée (Figure 3.8). Comparé au TOCSY classique ¹H-¹H basé sur les constantes de couplage ²JH-H et ³JH-H (4-10 Hz), ce type

^{de transfert est bien plus efficace car il repose sur le couplage fort 1J}C-C ^{(35-55 Hz). Il en est}

de même pour le transfert COSY ¹³C-¹³C de l'expérience HCCH-COSY qui est basé sur cette même constante de couplage ¹JC-C. La bonne sensibilité de ces expériences s'explique également par des transferts de cohérence rapides entre les noyaux ¹H et ¹³C via la constante

de couplage ¹JC-H (125-250 Hz).

HCCH-TOCSY

¹H ^Häi

^Hãi

H

A) H

N H H H

C C C C B)

Hâi

Hái

13C

^á â ^ã ä

Cãi

O C H H H

Hái

^{Hãi 1}H

Cái

Figure 3.8 : Attribution des noyaux ¹H et ¹³C des chaînes latérales aliphatiques et aromatiques. A) Description du transfert de l'aimantation dans une expérience 3D de double résonance HCCH-TOCSY. Les noyaux édités en fréquence sont indiqués par des cercles noirs

et le transfert TOCSY ¹³C-¹³C est indiqué par un trait ondulé. B) Exemple illustré de spectre HCCH-TOCSY. Mise en évidence du système de spin de 2 protons Há et Hã appartenant au même résidu et respectivement portés par les carbones Cá et Cã.

1.3.2) Attribution des chaînes latérales aliphatiques

Les fréquences de résonance des noyaux ¹H et ¹³C de chaîne latérale aliphatique se déterminent à partir des spectres HCCH-TOCSY et HCCH-COSY édités sur la région

aliphatique. Dans l'optique d'obtenir des spectres de bonne qualité, il est préférable

d'enregistrer ces 2 expériences sur un échantillon de protéine doublement marquée ¹⁵N / ¹³C, préalablement lyophilisé, et repris dans 100 % de D2O. Les valeurs de déplacement chimique

^{de 13C}á^{, 13C}â^{, 1H}á ^{et 1H}â ^{servent de point de départ pour identifier les autres résonances}

aliphatiques de chaîne latérale.

1.3.3) Attribution des chaînes latérales aromatiques

Les raies de résonance des protons et carbones de chaîne latérale aromatique s'attribuent en deux étapes. Dans un premier temps, les systèmes de spin aromatiques se déterminent à partir de l'expérience HCCH-TOCSY, éditée sur la région aromatique, et enregistrée sur un échantillon doublement marqué en solvant D2O. Les valeurs de déplacement chimique ¹³C des cycles aromatiques sont spécifiques du type d'acide aminé, ils permettent ainsi la distinction entre les différents cycles. L'attribution de ces systèmes se réalise ensuite en recherchant les nOe intra-résiduels qui corrèlent les noyaux ¹Há et ¹Hâ aux noyaux ¹H aromatiques sur le spectre ¹³C-NOESY-HSQC, édité sur la région aliphatique et enregistré sur le même type d'échantillon.

Dans le cas du domaine K2, les expériences 3D HCCH-COSY et HCCH-TOCSY suffisent pour identifier la quasi-totalité des résonances aliphatiques et aromatiques. Cependant, la forte similarité de déplacement chimique de certains types de noyaux aliphatiques ¹H et ¹³C induit généralement la présence de nombreuses zones de recouvrement

sur les spectres, qui ne permet pas toujours une attribution sans ambiguïté. Pour une protéine

de cette taille, la stratégie peut alors consister à enregistrer d'autres expériences de type 3D ou

4D, qui corrèlent les noyaux ¹H ou ¹³C aliphatiques au groupement amide du résidu suivant

(Grzesiek et al., 1993 ; Logan et al., 1993).