Production de domaines recombinants PRODH en vue de l'analyse structurale & Caractérisation de la région 51-160 de la protéine KIN17 humaine par RMN et Modélisation Moléculaire

2.2) Détermination de la structure secondaire et de la topologie

L'extraction des paramètres structuraux RMN est la méthode classique qui permet d'identifier rapidement la structure secondaire d'une protéine. L'analyse consensus de ces paramètres conduit à l'obtention des premiers éléments de structure tertiaire, utilisés par le programme d'attribution automatique en amont du calcul de la structure.

2.2.1) Les déplacements chimiques secondaires

Le déplacement chimique des noyaux de la chaîne principale d'un résidu est influencé

par plusieurs facteurs dont la structure secondaire dans laquelle celui-ci est engagé. Wishart et Sykes ont mis au point une méthode qui permet d'apprécier les types, et les positions dans la séquence, des éléments de structure secondaire à partir du déplacement chimique des noyaux

^{13CO, 13C}á^{, 13C}â^{, et 1H}á ^{(Wishart et al., 1992 ; Wishart & Sykes, 1994). La procédure consiste}

à calculer la différence entre le déplacement chimique expérimental (äobs) et une valeur de référence (äref) correspondant au même noyau pour le même acide aminé dans une conformation aléatoire. La valeur obtenue est appelée déplacement chimique secondaire (CSD

ou Chemical Shift Deviation). Les indices CSD n'ont pas la même signification selon la nature du noyau. Ainsi, pour le proton ¹H, une succession d'indices supérieurs à 0.1 ppm en valeur absolue reflète une structure secondaire stable et le signe en précise le type : positif pour un feuillet â, et négatif pour une hélice á ou 310. Dans le cas des ¹³Cá, il s'agit

exactement du contraire, et la valeur significative de CSD est de 1 ppm.

2.2.2) La constante de couplage ³JHN-Há

Les angles et sont deux des trois angles de torsion qui décrivent le squelette peptidique d'une protéine. La combinaison d'effets stériques, au sein d'un même résidu, ou entre les chaînes latérales, ne permet à ces angles de prendre que certaines valeurs qui définissent les différents types de structure secondaire. La constante de couplage ³JHN-Há est reliée indirectement à l'angle dièdre via l'équation de Karplus (2.3) avec les coefficients semi-empiriques A, B, et C (Karplus, 1959). Plusieurs jeux de coefficients ont été proposés, et ceux utilisés par Pardi et al., sont les plus communément admis (2.4) (Pardi et al., 1984). La résolution de l'équation fait apparaître que les valeurs idéales de constante ³JHN-Há sont de 4Hz pour l'hélice á (-57°), et de 9 Hz pour le feuillet â antiparallèle (-139°). Plusieurs études statistiques, comme celle menée par Smith et al., sur 85 structures résolues par radiocristallographie, ont cependant conduit à considérer des valeurs corrigées de ³JHN-Há (Smith et al., 1996). Sur la base de ces études, il est généralement admis que plusieurs valeurs

de ³JHN-Há consécutives inférieures à 5.5 Hz indiquent une conformation hélicoïdale, alors que

des valeurs supérieures à 8 Hz reflètent une structure en feuillet ou étendue.

O ^{C) 3}JHN-Há = 6,4.cos² è - 1,4.cos è + 1,9

A) ^N

^C'

C'

^{Cá N}

10

8

J

3

^HN-Há 6

avec è = |-60°| (2.4)

^O [Hz]

4

³JHN-Há = A.cos² è - B.cos è + C

^B) avec è = | - 60°| (2.3)

2

-180 -120 -60

0 60

[°]

120

180

Figure 3.9 : Estimation de l'angle dièdre à partir de la constante de couplage ³JHN-Há.

A) Définition des angles de torsion et du squelette peptidique. B) Relation de Karplus

liant la constante ³JHN-Há aux angles è et . C) Résolution de l'équation de Karplus selon les coefficients de Pardi.

Dans le cas des protéines, les constantes de couplage ³JHN-Há sont généralement estimées à partir de l'expérience 3D HNHA, qui met en évidence la corrélation intra- résiduelle entre un groupement amide (¹HN, ¹⁵NH) et son proton alpha (¹Há). Sur les spectres correspondants, le rapport d'intensité entre le pic croisé négatif (Ic) et le pic diagonal positif

(Id) est relié à la constante ³JHN-Há via une constante å (Vuister & Bax, 1993) :

Ic / Id = -tan² (2ðå . ³JHN-Há )

(2.5)

2.2.3) Recherche des nOe caractéristiques

Comme suggéré dans le paragraphe 2.1.2, chaque type de structure secondaire donne naissance à des pics nOe spécifiques en nature et en intensité sur les spectres NOESY. Aussi,

la méthode classique proposée par Wüthrich pour identifier les éléments de structure secondaire consiste à reporter sur un diagramme les nOe caractéristiques entre protons appartenant à des résidus proches dans la séquence (Wüthrich, 1986) (Figure 3.10A). Ces nOe sont facilement identifiables sur les spectres NOESY-HSQC éditée ¹⁵N, et un simple examen

de ce diagramme suffit en théorie à discerner de manière univoque les différents types de

conformation au sein de la protéine.

A) B)

H

H

Figure 3.10 : Identification des éléments de structure secondaire et de la topologie d'une

protéine à partir de l'attribution de pics nOe spécifiques. A) Diagramme des nOe caractéristiques des différents types de structure secondaire selon Wüthrich (Wüthrich,

1986). B) Description schématique d'un feuillet â antiparallèle. Les liaisons hydrogène sont

représentées par des pointillés jaunes. Les traits rouges représentent le type de connectivité longue distance recherchée.

Une fois les éléments de structure secondaire identifiés à partir du résultat consensus

de l'analyse des paramètres structuraux, la topologie de la protéine est déterminée en recherchant des effets spécifiques à longue distance de type HN-HN, HN-Há, et Há-Há au niveau des résidus n'adoptant pas de structure hélicoïdale. La caractérisation de ces effets permet d'une part, de distinguer les régions étendues de celles impliquées dans un feuillet â et d'autre part, de caractériser l'organisation des brins au sein des feuillets (parallèle ou antiparallèle) (Figure 3.10B). Ces éléments de structure tertiaire facilement identifiables sont extrêmement précieux car ils fournissent les premières informations du repliement de la protéine, et vont guider le programme d'attribution automatique des nOe.

2.2.4) Le nOe hétéronucléaire ¹H-¹⁵N

Comme nous l'avons évoqué précédemment, le phénomène de relaxation croisée entre deux spins dépend essentiellement de la distance r entre les deux noyaux, et du temps de corrélation effectif ôc entre les deux spins, c'est-à-dire de l'amplitude de leur mouvement. Dans l'approximation d'une distance fixe entre les atomes ¹⁵NH et ¹HN (rHN ~ 1.01 Å), le paramètre nOe hétéronucléaire ¹H-¹⁵N ne dépend plus que des mouvements rapides de la liaison NH-HN (de la picoseconde à la nanoseconde). D'autre part, ce type d'effet est indépendant des protons environnants (Kay et al., 1989). Par conséquent, la mesure du nOe

¹H-¹⁵N peut se révéler très utile pour distinguer les parties flexibles de la protéine, telles que

les boucles exposées ou les parties déstructurées (mouvements rapides), de la partie repliée

(mouvements plus lents).

En pratique, ce paramètre dynamique est quantifié à partir de deux expériences 2D similaires qui permettent d'observer la corrélation scalaire ¹H-¹⁵N de chaque résidu. Le premier spectre est enregistré avec une saturation préliminaire des ¹H qui engendre un transfert d'aimantation vers le ¹⁵N via le couplage dipolaire. Le second spectre est obtenu par

la même séquence d'impulsion, mais en absence de saturation des ¹H (Farrow et al., 1994).

Pour chaque pic de corrélation, le rapport entre l'intensité du pic saturé (Isat) et l'intensité du

pic non saturé (Iref) détermine alors le nOe hétéronucléaire (2.6). L'incertitude sur chaque valeur est calculée à partir des erreurs de mesure des intensités qui sont estimées par le bruit spectral sur chacun des deux spectres.

nOe (1H-15N) =

^Isat

^Iref

(2.6)

Les régions dans lesquelles les résidus ont une valeur de nOe ¹H-¹⁵N supérieure à 0.5 sont

considérées comme rigide, entre 0.2 et 0.5 comme relativement flexibles (boucles), et les acides aminés pour lesquels ce nOe est inférieur à 0.2 ou négatif appartiennent à des régions déstructurées de la protéine. Dans l'optique du calcul de la structure, la mesure du nOe hétéronucléaire fournit une information supplémentaire car elle permet d'identifier avec précision les résidus non structurés des extrémités N- et C-terminales. Aussi, sur les spectres

de type NOESY, les nOe homonucléaires ¹H observables correspondent à une moyenne

pondérée des nOe correspondants à chaque population de l'espace conformationnel. Dans le

cas de résidus en échange conformationnel très rapide, le poids de chaque population est

faible et les contacts de type longue distance sont incompatibles avec une telle flexibilité. Par

conséquent, la connaissance de ces résidus peut être utilisée par le programme d'attribution automatique des pics nOe afin de restreindre le nombre de possibilités d'attribution et donc de faciliter celle-ci.