Memoire Online - Production de domaines recombinants PRODH en vue de l'analyse structurale & Caractérisation de la région 51-160 de la protéine KIN17 humaine par RMN et Modélisation Moléculaire

L'attribution des raies de résonance des 111 acides aminés du domaine K2 a été réalisée selon la stratégie définie dans le chapitre précédent. Les différentes expériences 3D hétéronucléaires utilisées pour déterminer le déplacement chimique de chaque noyau, et recueillir les contraintes expérimentales, ont été enregistrées à 30°C et à pH 6.0 sur un spectromètre 600 MHz équipé d'une cryosonde triple résonance ¹H, ¹⁵N, ¹³C.

Un échantillon unique de protéine doublement marquée ¹⁵N / ¹³C concentrée à 0.7 mM

a suffi pour mener à bien l'attribution séquentielle du squelette peptidique. La combinaison des expériences HNCO, (HCA)CO(CAN)NH, HNCA, CBCANH, et CBCA(CO)NH a conduit à l'identification des valeurs de déplacement chimique des carbones ¹³CO, ¹³Cá, et

^13Câ ^{des résidus i et i-1 relatifs
à chaque groupement amide. Il est à noter que
l'expérience}

(HCA)CO(CAN)NH, plus sensible que HN(CA)CO, a été préférée pour obtenir les corrélations des ¹³CO intra- et inter-résidus. De plus, l'expérience HN(CO)CA, qui a également été enregistrée, n'a pu être exploitée en raison d'un problème d'artéfacts. L'interprétation de ces 5 expériences par paire a permis dans un premier temps de connecter

les résidus deux à deux, puis de reconstituer l'ensemble de la séquence peptidique à partir des acides aminés facilement identifiables tels que les glycines, thréonines, sérines, alanines, et prolines. La Figure 4.1 présente un exemple d'attribution séquentielle de la région F23-L28. L'attribution de la chaîne principale a finalement été complétée par l'analyse des spectres HNHA et HBHA(CO)NH.

L'optimisation préalable des conditions d'analyse a permis d'obtenir des spectres de qualité qui contiennent une quantité d'information satisfaisante. Dès lors, la bonne dispersion

^{des pics sur le spectre HSQC 15N-1H a facilité
l'attribution de la totalité des résonances
1H}N^,

1Há, ¹⁵NH, ¹³CO, et ¹³Cá du domaine K2 à l'exception des résidus G1, Q2, et R53 dont les déplacements chimiques du groupement amide sont manquants. L'absence de corrélation

¹⁵N-¹H de résidu appartenant à une extrémité flexible N- ou C-terminale est un phénomène classique qui s'explique par l'échange rapide du proton amide exposé au solvant avec les

protons de l'eau. Aussi, en anticipant sur la résolution de la structure tridimensionnelle,

Figure 4.1 : Attribution des fréquences ¹³CO, ¹³Cá, et ¹³Câ de la région F23-L28 du domaine

K2. Les bandes sont extraites des plans ¹⁵N des spectres, A) HNCO (en bleu) et (HCA)CO(CAN)NH (en rouge), B) CBCA(CO)NH (en bleu) et HNCA (en rouge), et C) CBCA(CO)NH (en bleu) et CBCANH (en rouge) au déplacement chimique ¹HN des résidus correspondants. Le chemin d'attribution est indiqué par des lignes horizontales fléchées.

l'échange rapide du proton amide R53 peut être expliqué par son appartenance à un résidu

Les fréquences de résonance des noyaux ¹H et ¹³C des chaînes latérales ont été déterminées à partir des spectres HCCH-TOCSY, HCCH-COSY, et ¹³C-NOESY-HSQC. Un échantillon unique de protéine doublement marquée ¹⁵N / ¹³C concentrée à 0.7 mM, préalablement lyophilisée, puis solubilisée dans du D2O (99.9 %) a suffi pour enregistrer l'ensemble de ces expériences sur les régions aliphatiques et aromatiques. La totalité des noyaux des chaînes latérales aliphatiques des 111 acides aminés de K2 a été attribuée. En ce

qui concerne les chaînes aromatiques, toutes les fréquences de résonance des résidus histidine, tyrosine, et tryptophane ont été identifiées à l'exception des proton et carbone Z2 du résidu W63. Le bilan de l'attribution est plus mitigé pour les phénylalanines, et seules 3 des 6 chaînes latérales ont été totalement attribuées (F19, F23, et F15). Par ailleurs, l'expérience

¹⁵N-TOCSY-HSQC a été enregistrée sur un échantillon uniformément marqué ¹⁵N afin de

vérifier l'attribution. Cependant, compte tenu de la faible efficacité du transfert TOCSY ¹H notamment due à la taille de la protéine K2, moins de la moitié des valeurs de déplacement chimique aliphatique ¹H a pu être contrôlée. La dernière étape de l'attribution du domaine K2

a consisté à enregistrer le spectre ¹⁵N-NOESY-HSQC sur l'échantillon ¹⁵N, ce qui a permis

d'attribuer la totalité des 13 groupements NH2 de résidus asparagine et glutamine à l'exception de N42.

L'identification des fréquences de résonance du domaine K2 de la protéine KIN17 humaine a fait l'objet d'une note d'attribution soumise et acceptée dans la revue Journal of Biomolecular NMR (Carlier et al., 2006). Cet article, présenté dans les pages suivantes, est accompagné d'un supplément technique (Supplemental Material) disponible sur le site de J.Biomol.NMR. à l'URL suivante : http://dx.dio.org/10.1007/10858-006-0013-y.

NMR assignment of region 51-160 of human KIN17, a DNA and RNA-binding protein

KIN17 is a 45 kDa nuclear protein which is remarkably conserved in eukaryotes, ubiquitously expressed in mammals, and forms intra-nuclear foci in proliferating cells. Major features of KIN17 are its ability to bind DNA and RNA and to be up-regulated in response to UV and irradiation, suggesting a role in DNA replication, the DNA damage response or RNA processing (Pinon-Lataillade et al., 2004; Miccoli et al.,

2005). Human KIN17 comprises an N-terminal zinc finger (27-50) and a C-terminal KOW motif (335-373). Here we report the ¹H, ¹⁵N, ¹³C assignments of the region 51-160 of human KIN17 as a preliminary step toward obtaining the atomic structure of this region and elucidating its biological function.

Residues corresponding to the KIN17 domain were all identified: 99% of the backbone chemical shifts, and

for the side chains, all the aliphatic and 88% of the aromatic ¹H-¹³C nuclei were assigned. BMRB deposit with accession number 6938.

References: Miccoli et al. (2005) Mol. Cell. Biol., 25, 3814-3830; Pinon-Lataillade et al. (2004) J. Cell. Sci.,

Ludovic Carlier^a, Albane le Maire^b, Sandrine Braud^b, Cedric Masson^b, Muriel Gondry^b, Sophie Zinn-Justin^a, Laure Guilhaudis^a, Isabelle Milazzo^a, Daniel Davoust^a, Bernard Gilquin^b& Joël Couprie^b,^*

^aEquipe de Chimie Organique et Biologie Structurale, CNRS UMR 6014, IFRMP 23, Université de Rouen, France; ^bDépartement d'Ingénierie et d'Etude des Protéines, CEA Saclay, 91191, Gif-sur-Yvette, France

Supplementary material is available in electronic format at http://dx.dio.org/10.1007/10858-006-0013-y.

Chapitre 4 : Caractérisation structurale du domaine K2 par RMN et Modélisation Moléculaire

Ludovic Carlier^a, Albane le Maire^b, Sandrine Braud^b, Cédric Masson^b, Muriel Gondry^b, Sophie Zinn-Justin^b, Laure Guilhaudis^a, Isabelle Milazzo^a, Daniel Davoust^a,

^aEquipe de Chimie Organique et Biologie Structurale, IFRMP 23, CNRS UMR 6014, Université de Rouen

^bDépartement d'Ingénierie et d'Etude des Protéines, CEA Saclay, 91191 Gif-sur-Yvette, France.

Chapitre 4 : Caractérisation structurale du domaine K2 par RMN et Modélisation Moléculaire

KIN17 is a 45 kDa nuclear protein conserved in eukaryotes and initially identified on

the basis of its cross-reactivity with antibodies raised against bacterial RecA, a recombination-repair enzyme (Kannouche et al., 2000). In mammals, the KIN17 protein is ubiquitously expressed. It forms intranuclear foci in proliferating cells and is up-regulated after UV or ã irradiation (Biard et al., 2002; Kannouche et al., 1998). The other features of KIN17 are its ability to bind DNA and RNA in vitro and in vivo (Biard et al., 2002; Pinon- Lataillade et al., 2004), to associate with multiprotein DNA replication complexes (Miccoli et

al., 2005), and to complement the functions of the bacterial transcriptional factor H-NS (Timchenko et al., 1996), suggesting a role in nuclear metabolism.

Human KIN17 is a modular protein comprising four motifs: a zinc finger (28-50) at

the N-terminus, a core domain homologous to RecA protein (163-201), a nuclear localization signal (240-257), and a KOW motif (335-373) found in several bacterial transcription factors (Kannouche et al., 2000; Ponting et al., 2002). On the basis of sequence alignment and secondary structure prediction, we identified a globular region located between the zinc finger

and the core domain. We here report the ¹H, ¹⁵N, ¹³C assignments of the region 51-160 as a

preliminary step toward obtaining the atomic structure of this KIN17 domain and elucidating

The gene encoding the region 51-160 of human KIN17 was amplified by polymerase chain reaction (PCR) and cloned into several expression vectors using the Gateway system (Invitrogen). A protein expression screening using different strains and fusion partners was performed (Braud et al., in press) and highest levels of expression and solubility were obtained when transforming E. coli Rosetta(DE3) strain with plasmid pEXP-TH5 (Invitrogen). This vector encodes a 6xHis tag, the Z-domain from Staphylococcal Protein A (ZZ), a TEV protease (Tobacco Etch Virus) cleavage site, and the KIN17 51-160 domain. Protein expression was induced by the addition of 1 mM of isopropyl-1-thio-â-D- galactopyranoside (IPTG) to the bacterial culture at a cell density of 1.2 absorbance units measured at 595 nm. The bacterial culture was further grown for 14 hours at 20°C.

The fusion protein was purified using IgG Sepharose Fast Flow (Amersham) in order

Chapitre 4 : Caractérisation structurale du domaine K2 par RMN et Modélisation Moléculaire

to separate the fusion protein from other bacterial proteins and to remove the (His)6-ZZ tag after an on-column cleavage using recombinant (His)6-TEV protease. A second step of purification was performed using Ni-NTA column (Qiagen) to remove (His)6-TEV protease and residual (His)6-ZZ tag.

1 g.L^-1of (¹⁵NH4)2SO4 (Boehringer) as the sole nitrogen source. Uniformly labelled ¹³C/ ¹⁵N protein was produced in a rich medium prepared from uniformly labelled ¹³C/¹⁵N Spirulina maxima cyanobacteria. NMR samples containing about 0.7 mM protein were prepared in 50 mM phosphate buffer pH 6.0 containing 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, a protease inhibitor cocktail (SIGMA), 1 mM TCEP, and 1 mM NaN3 in either 90% H2O/10% D2O or in 100% D2O. 3-(trimethylsilyl)[2,2,3,3-²H4] propionate (TSP) was added as an internal ¹H chemical shift reference. ¹³C and ¹⁵N chemical shifts were referenced indirectly to TSP, using the absolute frequency ratios (Wishart et al., 1995).

NMR experiments were performed at 303 K on Bruker AVANCE DMX-600 or Varian INOVA-800 spectrometers equipped with triple-resonance (¹H, ¹⁵N, ¹³C) cryoprobes. Spectra used for sequential backbone assignment were as follows: 2D ¹⁵N-¹H HSQC, 3D HNCO, 3D HNCA, 3D CBCA(CO)NH, 3D CBCANH, 3D HNHA, 3D (HCA)CO(CAN)NH experiments. Aliphatic and aromatic ¹H and ¹³C side chain assignments were obtained using

experiments. All NMR data were processed with NMRPipe software (Delaglio et al., 1995)

For cloning strategy reasons, this KIN17 domain contains the region 51-160 of human KIN17 plus an additional glycine residue at the N terminus. Figure 1 shows the ¹⁵N-¹H HSQC spectrum of the 111 residues protein numbered from 1 to 111. All the amide ¹H and ¹⁵N backbone resonances were assigned except for N-terminal amino acids G1 and Q2, and R53 whose NH is unobservable presumably due to loop mobility or chemical exchange since this residue is located between secondary structure elements.

Chapitre 4 : Caractérisation structurale du domaine K2 par RMN et Modélisation Moléculaire

Compared to the expected number of resonances, nine additional weakened cross- peaks were observed in the ¹⁵N-¹H HSQC spectrum. However, backbone and side chain assignments, as well as 3D ¹⁵N HSQC-NOESY patterns revealed that 6 spin systems split in

two (R3, Q4, L5, L6, A8, S9). Those residues are located before the proline P12 and we suppose that the minor form is due to a partial isomerisation of P12. The observation of a characteristic strong NOE between Hä of P12 and Há of N11 indicated that the predominant form of this proline is in a trans conformation.

Finally, all residues corresponding to the region 51-160 of KIN17 were identified: the backbone assignment is complete for ¹Há, ¹³Cá and ¹³CO, and it reaches 98% for ¹HN and ¹⁵N nuclei. All the aliphatic side chain resonances were assigned and 88% of the aromatic ¹H and

¹³C resonances were identified, including all Tyr and His aromatic rings, 3 Phe out of 6, and 2

Trp out of 3. Assignments of NH2 side chain resonances of asparagines and glutamines were also completed except for N42. The ¹H, ¹³C and ¹⁵N chemical shifts have been deposited in

de Haute-Normandie (France). We are grateful to Dr Adrien Favier who kindly recorded 3D HSQC NOESY experiments on Varian INOVA-800 spectrometer at I.B.S Jean-Pierre Ebel (Grenoble, France), and to Marie Courçon and Mireille Moutiez for the protein expression screening. We also thank the Centre de Ressources Informatiques de Haute-Normandie (France) for NMR software facilities.

Braud, S., Moutiez, M., Belin, P., Abello, N., Drevet, P., Zinn-Justin, S., Courçon, M., Masson, C., Dassa, J., Charbonnier, J.B., Boulain, J.C., Ménez, A., Genet, R., Gondry, M. (2005). J. Proteome Res., In press.

Biard, DS., Miccoli, L., Despras, E., Frobert, Y., Creminon, C. and Angulo, JF. (2002)

Delaglio, F., Grzesiek, S., Vuister, G. W., Zhu, G., Pfeifer J. and Bax, A. (1995) J. Biomol. NMR., 6, 277-293.

Chapitre 4 : Caractérisation structurale du domaine K2 par RMN et Modélisation Moléculaire

Kannouche, P., Mauffrey, P., Pinon-Lataillade, G., Mattei, MG., Sarasin, A., Daya-Grosjean,

Kannouche, P., Pinon-Lataillade, G., Tissier, A., Chevalier-Lagente, O., Sarasin, A., Mezzina,

Miccoli, , L., Frouin, I., Novac, O., Di Paola, D., Harper, F., Zannis-Hadjopoulos, M., Maga, G., Biard, D.S.F., Angulo, J.F. (2005). Mol. Cell. Biol., 25(9), 3814-3830.

Pinon-Lataillade, G., Masson, C., Bernardino-Sgherri, J., Henriot, V., Mauffrey, P., Frobert, Y., Araneda, S. and Angulo, JF. (2004) J. Cell. Sci., 117(16), 3691-3702

Wishart, DS., Bigam, CG., Yao, J., Abildgaard, F., Dyson, HJ., Oldfield, E., Markley, JL. and

assignments are indicated with the one-letter amino acid code. NH2 side chain resonances of asparagines and glutamine are connected by purple horizontal lines.

Chapitre 4 : Caractérisation structurale du domaine K2 par RMN et Modélisation Moléculaire

La première étape de la caractérisation structurale du domaine K2 a consisté à déterminer les éléments de structure secondaire à partir de paramètres structuraux et dynamiques RMN afin d'établir la topologie de la protéine.

Nous avons dans un premier temps réalisé une expérience de mesure des nOe hétéronucléaires ¹H-¹⁵N dans le but d'identifier les résidus non structurés des extrémités N- et

C-terminales. Les spectres ont été enregistrés à 600 MHz sur un échantillon uniformément

Figure 4.2 : nOe hétéronucléaires ¹H-¹⁵N du domaine K2 de la protéine humaine KIN17. Les astérisques correspondent aux résidus dont la valeur n'a pas été déterminée ou aux résidus proline.

Les faibles valeurs de nOe hétéronucléaire (<0.25) observées au niveau des extrémités

N- et C-terminales mettent en évidence que les régions R3-N11 et K108-K111 sont flexibles

et déstructurées (Figure 4.2). L'échange rapide du proton amide de Q2 avec l'eau n'ayant pas permis de mesurer sa valeur de nOe ¹H-¹⁵N, et le résidu 12 étant une proline, il semble raisonnable de conclure que les segments G1-P12 et K108-K111 sont déstructurés.

Chapitre 4 : Caractérisation structurale du domaine K2 par RMN et Modélisation Moléculaire

La caractérisation des éléments de structure secondaire a été initiée en calculant les indices de déplacement chimique CSD à partir des valeurs de déplacements chimiques Há et

^Cá^{, et des valeurs de
référence correspondantes dans la BioMagResBank. La
figure 4.3 montre}

le diagramme des indices ?äCá et ?äHá du domaine K2. La majorité des résidus présente une valeur positive de ?äCá conjuguée à une valeur négative de ?äHá, ce qui suggère une structuration hélicoïdale importante. Pour être significatives, les valeurs de ?äCá et ?äHá doivent atteindre respectivement, 1, et 0.1 ppm. Sur la base de ces valeurs seuils, 4 hélices sont clairement identifiables au niveau des régions D17-R33, H41-S51, L66-R75, et P97- E107. A contrario, la région C79-Q91 se caractérise plutôt par des valeurs négatives de ?äCá conjuguées à des valeurs positives de ?äHá, ce qui indique une conformation en feuillet â ou étendue. Cependant, le signe des indices CSD dans cette région est irrégulier, et l'amplitude

Afin d'approfondir la caractérisation des structures secondaires, nous avons entrepris

une analyse partielle du spectre ¹⁵N-NOESY-HSQC enregistré à 600 MHz sur un échantillon uniformément marqué ¹⁵N concentré à 0.8 mM. Selon la stratégie définie dans le chapitre 2, nous nous sommes contentés de collecter 3 types de nOe non ambiguës facilement identifiables. Il s'agit des corrélations caractéristiques de type dáN(i, i+1), dáN(i, i+2), et dáN(i, i+3). Nous avons également estimé les constantes de couplage ³JHN-Há à partir des expériences 3D HNHA et 2D HMQC_J enregistrées sur l'échantillon ¹⁵N. L'analyse combinée des nOe caractéristiques et des constantes de couplage ³JHN-Há (Figure 4.4) permet

de préciser la nature des éléments de structure secondaire mis en évidence précédemment :

L'observation de contacts dáN(i, i+3) consécutifs associés à de faibles intensités de nOe dáN(i, i+1), et à une absence d'effets dáN(i, i+2), caractérise une structuration des 4 régions D17-L31, N42-S51, L66-G77, et P97-Q103 en hélice á. En ce qui concerne l'hélice

C-terminale, la forte similarité des valeurs de déplacement chimique Há dans la région L104- K110 ne permet pas de relever d'effets supplémentaires non ambiguës au delà du résidu 103.

Les valeurs consécutives de ³JHN-Há inférieures à 5.5 Hz au niveau des régions F15-R33, H41-

Y49, D68-R75, et D96-E105 confirment l'existence de ces 4 hélices. Notons toutefois que 3

des valeurs de constante ³JHN-Há du segment H41-Y49 (I44, V45, et E48) se situent entre 5.5

Chapitre 4 : Caractérisation structurale du domaine K2 par RMN et Modélisation Moléculaire

^?äCá
5	10	15	20	25	30	35	40	45	50	55	60	65	70	75	80	85	90	95	100	105	110
?äHá
5	10	15	20	25	30	35	40	45	50	55	60	65	70	75	80	85	90	95	100	105	110

Figure 4.3 : Déplacements chimiques secondaires du domaine K2 de la protéine KIN17 humaine calculés à partir de valeurs de référence de la

Chapitre 4 : Caractérisation structurale du domaine K2 par RMN et Modélisation Moléculaire

^{GQRQLLLASENPQQFMDYFSEEFRNDFLELLRRRFGTKRVHNNIVYNEYISHREHIHMNATQWETLTDFTKWLGREGLCKVDETPKGWYIQYIDRDPETIRRQLELEKKKK}

⁵

¹⁰

¹⁵

²⁰

²⁵

³⁰

³⁵

⁴⁰

⁴⁵

⁵⁰

⁵⁵

⁶⁰

⁶⁵

⁷⁰

⁷⁵

⁸⁰

⁸⁵

⁹⁰

⁹⁵

¹⁰⁰

¹⁰⁵

¹¹⁰

^{GQRQLLLASENPQQFMDYFSEEFRNDFLELLRRRFGTKRVHNNIVYNEYISHREHIHMNATQWETLTDFTKWLGREGLCKVDETPKGWYIQYIDRDPETIRRQLELEKKKK}

Figure 4.4 : Diagramme récapitulatif de 3 effets Overhauser caractéristiques et des constantes de couplage ³JHN-Há du domaine K2 de KIN17 humaine. L'épaisseur des traits rouges, bleus, et verts indique respectivement, l'intensité des effets à courte et moyenne distance de type dáN(i, i+1), dáN(i, i+3), et dáN(i, i+2) relevés sur le spectre NOESY-HSQC édité ¹⁵N. Les lignes horizontales violettes représentent les valeurs

seuil de constante de couplage ³JHN-Há dans les structures secondaires (<5.5 Hz dans l'hélice á ou 310, >8 Hz dans le feuillet â). Les traits

^{inclinés correspondent aux résidus dont la
valeur de 3J}HN-Há ^{n'a pas été
déterminée.}

De manière générale, peu de connexions non ambiguës de type dáN(i, i+2) ont été

relevées sur le spectre ¹⁵N-NOESY-HSQC. Ces effets sont caractéristiques d'une structuration en hélice 310 ou en coude. L'observation de 2 contacts consécutifs de moyenne intensité de type dáN(i, i+2) et d'un effet dáN(i, i+3) au niveau du segment M58-T61 suggère l'existence potentielle d'un tour d'hélice 310. Cette hypothèse est consolidée par une faible valeur de ³JHN-Há (<4.5 Hz), et une valeur significative d'indice ?äCá des résidus M58 et N59.

La succession d'effets dáN(i, i+1) de forte intensité associés à une absence quasi-totale d'effets dáN(i, i+3) et dáN(i, i+2) au niveau des régions C79-T84 et W88-D94 confirme la présence d'une zone étendue ou structurée en feuillet â dans la région C79-D94. Les fortes valeurs de constante ³JHN-Há (>8 Hz) au niveau des résidus K80 à D82, T84, K86, Y89 à Q91,

et I93 sont en accord avec ce résultat. D'autre part, le diagramme de la Figure 4.4 fait

apparaître 4 fortes intensités dáN(i, i+1), un contact dáN(i, i+2), et 3 valeurs de ³JHN-Há supérieures à 8 Hz dans la région T35-N42. Ce profil laisse présager la présence d'un ou plusieurs types conformationnels : coude(s), brin â, ou zone étendue. Aussi, il est difficile de caractériser la structure secondaire de cette zone à partir de ces seules données. Les valeurs significatives d'indice ?äHá des résidus T37, R39 et V40 (> +0.2 ppm), et la forte valeur de

^?äCá ^{du résidu V40 (-1.9 ppm)
supportent l'hypothèse de l'existence d'un brin â.}

Le déplacement chimique des noyaux ¹³Cá, ¹³Câ, ¹³CO, ¹Há, et ¹⁵NH a été utilisé pour estimer les angles dièdres et caractéristiques des structures secondaires à l'aide du logiciel TALOS. Dans le cas du domaine K2, 68 des 111 valeurs de couple d'angles et prédites sont considérées comme fiables. Une grande partie de ces valeurs se situe dans la région spécifique aux hélices á du diagramme de Ramachandran, ce qui confirme une structuration hélicoïdale importante. Sur la base de cette prédiction, 4 hélices á sont identifiables au niveau

des régions Y18-R34, N42-I50, T67-R75, et E98-L106. Le programme TALOS prédit également la présence de 3 zones étendues ou structurées en brin â au niveau des segments R39-H41, C79-T84, et W88-Y92. De plus, les valeurs d'angles dièdres prédites pour les résidus M58 et N59 sont caractéristiques d'une hélice 310, ce qui conforte l'hypothèse de la présence d'un tel motif dans cette région du domaine K2. Par ailleurs, les valeurs particulières d'angles et créditées aux résidus isolés R53 et E54, ainsi qu'aux résidus E76, P85, et K86,

Afin de préciser la structure secondaire des régions qui présentent une préférence conformationnelle étendue, nous avons entrepris une recherche d'effets spécifiques à longue distance de type HN-HN, HN-Há, et Há-Há sur les spectres ¹⁵N- et ¹³C-NOESY-HSQC. L'analyse de ces effets met en évidence l'existence d'un feuillet â anti-parallèle triple brin dans lequel le brin central G87-I93 est encadré par un second de même taille qui le précède dans la séquence (L78-T84), et par un troisième beaucoup plus court (V40-N42) (Figure 4.5).

Les résultats de l'expérience de spectroscopie d'échange ¹H ? ²D menée sur un échantillon

¹⁵N / ¹³C solubilisé dans 100% D2O sont en accord avec une telle organisation : le ralentissement constaté de la vitesse d'échange des protons amides T84, Y89, I90, Q91, et I93 suggère une implication de ces protons dans une liaison hydrogène, et confirme leur appartenance à une structure secondaire régulière (Figure 4.5).

Figure 4.5 : Reconstitution de la topologie du feuillet â anti-parallèle du domaine K2 à partir

de l'analyse des nOe longue distance Há-Há (traits oranges), HN-HN (traits bleus), et HN-Há (traits verts). Les lignes hachurées correspondent aux liaisons hydrogène déduites de l'analyse des vitesses d'échange des protons amides et des nOe inter-brins.

La prise en compte de l'ensemble des informations structurales obtenues à partir des indices CSD, des constantes ³JHN-Há, des nOe ¹H caractéristiques, des nOe hétéronucléaires, de l'échange des protons amides, et de la prédiction des angles et , permet finalement de caractériser la topologie des structures secondaires (Figure 4.6). Le consensus réalisé à partir

de toutes ces informations met clairement en évidence l'existence de 4 hélices á (H1 à H4) et

de 3 brins â (S1 à S3). De plus, comme nous l'avons suggéré dans les paragraphes précédents,

^{plusieurs éléments sont en faveur de
l'existence d'un tour d'hélice 3}10 ^{dans la région
M58-}

T61. A ce stade de l'étude structurale, la présence de ce motif demeure une simple hypothèse

qui doit être confirmée par le calcul de la structure par modélisation moléculaire. Il en est de même pour l'orientation et la délimitation précise des structures secondaires, uniquement accessibles par la détermination de la structure tridimensionnelle à l'échelle atomique.

5	10	15	20	25	30	35	40	45	50	55	60	65	70	75	80	85	90	95	100	105	110
\|	\|	\|	\|	\|	\|	\|	\|	\|	\|	\|	\|	\|	\|	\|	\|	\|	\|	\|	\|	\|	\|

^{GQRQLLLASENPQQFMDYFSEEFRNDFLELLRRRFGTKRVHNNIVYNEYISHREHIHMNATQWETLTDFTKWLGREGLCKVDETPKGWYIQYIDRDPETIRRQLELEKKKK}

^\|	^\|	^\|	^\|	^\|	^\|	^\|	^\|	^\|	^\|	^\|	^\|	^\|	^\|	^\|	^\|	^\|	^\|	^\|	^\|	^\|	^\|
5	10	15	20	25	30	35	40	45	50	55	60	65	70	75	80	85	90	95	100	105	110

Figure 4.6 : Caractérisation de la structure secondaire du domaine K2 par RMN. Un

cylindre bleu correspond à une hélice á, un cylindre vert à une hélice 310, une flèche rouge à

un brin â, et un rectangle rouge à une région étendue ou à un brin â. Les traits noirs

prononcés indiquent l'étendue des extrémités flexibles et déstructurées et une étoile correspond à un résidu dont la vitesse d'échange de proton amide est ralentie.

1.3) Calcul de la structure par Modélisation Moléculaire sous contraintes RMN

La structure du domaine K2 de la protéine KIN17 humaine a été calculée avec le logiciel CNS couplé au programme d'attribution automatique des nOe du Laboratoire de Structure des Protéines. Les méthodes et principes sur lesquels reposent ces logiciels sont exposés dans le chapitre 3 de cette seconde partie.

Les spectres NOESY-HSQC utilisés pour déduire les contraintes de distance ont été enregistrés à l'IBS de Grenoble sur un spectromètre 800 MHz équipé d'une cryosonde triple résonance, avec un temps de mélange de 80 ms pour l'expérience éditée ¹⁵N, et de 100 ms pour l'expérience éditée ¹³C. Les pics de corrélation dipolaire ont été sélectionnés, intégrés, puis collectés à l'aide du logiciel Felix (Accelrys). Aucun de ces pics n'a été attribué manuellement à l'exception des 9 effets à longue distance de type HN-HN, HN-Há, et Há-Há

Les 136 valeurs d'angles et prédites par le logiciel TALOS ont été utilisées pour former les contraintes d'angle dièdre. Les intervalles de valeurs permises associés à ces angles

ont été établis en multipliant l'écart type estimé par TALOS pour chaque prédiction par un coefficient d'une valeur de 1.5. Trois contraintes supplémentaires d'angle ont été ajoutées dans les protocoles de calcul sur la base d'une valeur de constante de couplage ³JHN-Há caractéristique des résidus F35, H55, et D96. Les intervalles de valeurs permises correspondants ont été déduits de la courbe de Karplus lissée en utilisant les coefficients de Pardi (Pardi et al., 1984).

Enfin, l'expérience de spectroscopie d'échange ¹H ? ²D et la caractérisation des éléments de structure secondaire ont permis de mettre en évidence l'existence de 18 liaisons hydrogène principalement localisées dans les hélices á (Figure 4.6). Ces informations ont été interprétées en contrainte de distance (dHN-O ~ 2.3 Å et dN-O ~ 3.3 Å) et introduites dans les protocoles de calcul.

Le calcul de la structure du domaine K2 a nécessité la répétition de 21 processus itératifs de 22 cycles où chaque itération a fait l'objet d'une attribution des pics nOe et d'un calcul de 200 structures. L'analyse conjointe des violations de distance et d'angles dièdres, ainsi que de la liste des pics nOe non attribués en fin de chaque processus a permis d'identifier, puis de corriger, les informations erronées. Ainsi, les pics qui correspondent à du bruit spectral ont été progressivement supprimés, et les erreurs d'attribution des fréquences de résonance de la protéine ont été rectifiées. Le jeu final de données expérimentales RMN retenu a conduit à l'attribution de 3347 pics nOe par le programme d'attribution automatique. Moins de 2% des pics de ce jeu final n'ont pas été attribués. Après application des différents filtres et suppression des nOe redondants, une liste de 2716 contraintes de distance contenant,

2192 contraintes non ambiguës, et 524 contraintes ambiguës, a finalement été établie, ce qui représente une vingtaine de contraintes de distance par résidu (Tableau 4.1).

Tableau 4.1 : Contraintes expérimentales utilisées pour le calcul final de la structure.

Les 20 structures de plus basse énergie de l'itération finale ont été sélectionnées et soumises à un protocole de raffinement dans le champ de force CHARMM22. A l'issue de cette dernière étape, les 12 meilleurs modèles ont été retenus et constituent l'ensemble final de

la structure du domaine K2 résolue par modélisation moléculaire sous contraintes RMN. Le

tableau 4.2 présente un résumé des statistiques structurales de ces 12 meilleures structures.

Dans l'ensemble, les faibles valeurs des différents termes de la fonction d'énergie suggèrent

que les modèles générés sont de bonne qualité. Aucune violation de distance supérieure à

0.5 Å ou d'angle dièdre et supérieure à 10° n'est observée, ce qui indique une bonne prise

en compte des contraintes expérimentales RMN. Ces structures présentent également une bonne géométrie covalente avec de faibles valeurs de déviation par rapport à la géométrie idéale des longueurs de liaisons, des angles de valence, et des angles dièdres impropres.

Résidus dans les régions favorables 88.6 % Résidus dans les régions additionnelles permises 10.1 %

Tableau 4.2 : Statistiques structurales de l'ensemble des 12 structures finales de K2.

La répartition des angles et sur le diagramme de Ramachandran confirme la qualité des structures. Plus de 99 % des valeurs de ces angles occupent les régions énergétiquement favorables ou permises, et seules 0.5 % sont situées dans les régions interdites. La distribution des angles dièdres et pour chaque résidu est présentée en Figure

4.8A. Les éléments de structure secondaire également reportés ont été définis à partir de ces

La convergence des modèles générés constitue également un critère de qualité. La

superposition des 12 structures finales sur les atomes de la chaîne principale (N, CO, et Cá) montre la bonne définition du squelette peptidique entre les résidus F15 et L106 (Figure 4.7). Pour les acides aminés situés entre ces 2 résidus, la moyenne des écarts quadratiques « rmsd » calculée sur le squelette de l'ensemble final par rapport à une structure moyenne est de

0.43 Å. Cette faible valeur indique une bonne convergence des modèles vers une structure

Figure 4.7 : Superposition des 12 structures finales du domaine K2 sur les atomes du

squelette (N, CO, et Cá) entre les résidus Q13 et E107. Les hélices á sont représentées en bleu, les feuillets â en rouge, l'hélice 310 en vert pastel, et les régions déstructurées en violet.

La Figure 4.8B montre les valeurs des écarts rmsd calculés sur le squelette et les atomes lourds de chaîne latérale pour chaque résidu. On constate une dispersion des angles

et associée à de fortes valeurs de rmsd au niveau des extrémités N- et C-terminales G1-P12

et K109-K111. Ceci est en accord avec l'analyse du nOe hétéronucléaire ¹H-¹⁵N (cf. § 1.2.1)

qui indique que ces 2 extrémités sont flexibles et déstructurées. A contrario, la bonne convergence des angles dièdres et les faibles valeurs de rmsd sur les atomes du squelette

(< 1 Å) des résidus F15 à L106 suggèrent que ces acides aminés constituent le corps globulaire de la protéine. Ainsi, on observe une bonne définition du squelette peptidique dans

les régions structurées en hélice et feuillet, mais également dans les boucles. D'autre part, la majorité des valeurs de rmsd calculées sur les atomes lourds de chaîne latérale sont inférieures

à 1.5 Å, ce qui démontre une orientation privilégiée de la plupart des chaînes latérales dans la région F15-L106. La moyenne des écarts rmsd sur les atomes lourds entre les résidus F15 et

Chapitre 4 : Caractérisation structurale du domaine K2 par RMN et Modélisation Moléculaire

Figure 4.8 : Analyse de la convergence des 12 structures finales sélectionnées. A) Distribution des angles dièdres et pour chaque acide aminé de ces 12 structures. Les traits oranges correspondent aux intervalles de contrainte d'angle définis dans CNS. B) Déviation quadratique moyenne rmsd pour chaque résidu calculée par rapport à la structure moyenne des 12 modèles sélectionnés (en bleu : superposition sur les atomes N, Cá, et CO du squelette ; en violet : sur tous les atomes lourds de chaîne latérale). Les résidus 36, 74, 77, et 87 sont des glycines.

Production de domaines recombinants PRODH en vue de l'analyse structurale & Caractérisation de la région 51-160 de la protéine KIN17 humaine par RMN et Modélisation Moléculaire

CHAPITRE 4

Caractérisation structurale du domaine K2

par RMN et Modélisation Moléculaire

1) Détermination de la structure du domaine K2 de KIN17 humaine

1.3) Calcul de la structure par Modélisation Moléculaire sous contraintes RMN