1.2) Optimisation de paramètres d'expression et
d'extraction
Comme nous l'avons évoqué
précédemment, les données de la littérature
indiquent que PRODH humaine est une enzyme mitochondriale localisée dans
la matrice et fixée à la membrane interne. Par conséquent,
la structure tertiaire de la forme native de cette protéine pourrait
présenter des surfaces hydrophobes exposées qui lui
permettrait de fixer les phospholipides de la membrane interne.
Lorsqu'elle est exprimée chez E. coli, ces surfaces hydrophobes
pourraient accrocher les membranes bactériennes, et ainsi
retenir la protéine hétérologue dans les fractions
contenant les protéines insolubles. Nous avons essayé de
recueillir la protéine recombinante PRODH dans la fraction soluble en
introduisant différents détergents non dénaturants dans le
tampon de lyse. Ces types de détergents amphiphiles, qui
dégradent les membranes bactériennes, interagissent
également avec les surfaces hydrophobes exposées des
protéines, et favorisent ainsi leur solubilisation en
présentant une extrémité polaire au solvant aqueux.
Trois détergents différents ont été
testés dans des gammes de concentration s'échelonnant de 1 %
à 5 % (v/v). Il s'agit du Triton X-100, du NP 40, et du Tween 20. Dans
tous les cas, nous ne sommes jamais parvenus à détecter PRODH
sauvage dans la fraction soluble. Les profils d'expression obtenus étant
tout à fait identiques à celui obtenu en absence de
détergent, nous en avons conclu que la protéine recombinante
PRODH humaine est produite sous forme de corps d'inclusion chez E.
coli.
Les corps d'inclusion sont des agrégats
insolubles composés principalement de protéine recombinante
mal repliée et biologiquement inactive. Leur formation est en
partie liée au taux d'expression du gène
hétérologue dans la bactérie. Ainsi, un taux d'expression
trop élevé favorise les interactions hydrophobes
intermoléculaires par rapport aux interactions internes, et
empêche le repliement correct de la protéine au profit de la
formation d'agrégats (Georgiou & Valax, 1999). L'urée
est un chaotrope puissant qui permet de dénaturer et solubiliser
ces corps d'inclusion. Dans certains cas, des concentrations
modérées d'urée de l'ordre de 2 à 3 M sont
suffisantes pour resolubiliser des protéines agrégées dont
le repliement
n'est pas trop éloigné du repliement natif (Clark,
2001). Dans le cas de PRODH la reprise de
la fraction insoluble par de l'urée 8 M pendant 6 heures
n'a pas été suffisante pour dénaturer
les corps d'inclusion contenant la protéine
recombinante ne serait-ce que partiellement. Ceci laisse supposer que plusieurs
segments hydrophobes de PRODH sont exposés en surface et
établissent de fortes interactions intermoléculaires au
sein des agrégats. Dans l'optique de limiter ce type d'interaction,
nous avons essayé de réduire les taux d'expression de PRODH,
d'une part en ralentissant le métabolisme bactérien par
une diminution de température de
37°C à 29°C, et d'autre part en diminuant la
quantité d'inducteur IPTG de 1 mM à 0.1 mM.
En parallèle, nous avons également
réalisé une optimisation de la DO d'induction en testant
les valeurs suivantes : 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, et 0.8. Dans
tous les cas de figure testés, aucune amélioration de
solubilité de la protéine recombinante n'a été
constatée.
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