II-8-2 Mode opératoire
Pour chaque composé à tester, des solutions sont
préparées dans le méthanol à différentes
concentrations. Pour chaque solution, 4 ml sont mélangés avec 10
ml d'une solution méthanoïque de DPPH de concentration 1.5 x
10-4 M. Après agitation, les mélanges ainsi
préparés sont incubés pendant 30 minutes à
l'obscurité. La densité optique à 520 nm est par la suite
déterminée. On représente ainsi la courbe donnant la
variation de la densité optique en fonction du logarithme décimal
de la concentration. L'activité antioxydante de chaque composé
est exprimée en IC50 (ug/ml) qui représente la
concentration du composé à tester nécessaire à la
neutralisation du 50 % des radicaux libres de DPPH. L'activité
antioxydante est d'autant plus forte que la valeur de l'IC50 est plus
faible.
II-9 Analyse des protéines
La concentration des protéines est
déterminée en suivant la méthode de Bradford (1976).
II-9-1 Principe de la méthode
Le test est basé sur l'absorbance d'une solution acide
de bleu de Coomassie G-250 à la longueur d'onde de 595 nm quand la
liaison aux protéines se produit. Les deux interactions hydrophobes et
ioniques stabilisent la forme anionique du colorant, entraînant un
changement de couleur visible. Le coefficient d'extinction est
déterminé selon une gamme étalon d'une solution de
Sérum Albumine Bovine (SAB) de concentration allant de 50 à 100
ug/ml de protéines.
II-9-2 Mode opératoire
On ajoute à 0,2 ml au réactif de Bradford, 0,8
ml d'une des solutions standard de protéines ou d'échantillons
à doser préalablement dilués.
II-10 Détermination de la concentration des sucres
réducteurs
Le réactif de DNS est préparé en
mélangeant 10,6 de l'acide 3,5- dinitrosalicylique et 19,8 g de Na OH
dans 1416 ml d'eau distillée. 306 g du tartrate de sodium et de
potassium, 8,1 g de phénol et 8,3 g de sulfate de sodium sont par la
suite additionné (Al-Zuhair, 2008). 100 ul de l'échantillon sont
mélangés avec 900 ul du tampon citrate (50 mM pH 4,8). Ensuite
1,5 ml de la solution de DNS sont additionnés au mélange et
chauffé dans l'eau bouillante pendant 10 minutes. Les
échantillons sont ensuite refroidis à la température
ambiante avec l'ajout de 10 ml d'eau distillée. L'absorbance à
550 nm est déterminée à l'aide du
spectrophotomètre. La solution blanc est constituée de 100 ul
d'eau distillée à la place de l'échantillon à
analyser. La gamme étalon est préparée dans la
série de 0 à 2 g/l de glucose.
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Matériel et Méthodes
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