II-6 Extraction des composés phénoliques
à partir des margines
L'extraction liquide-liquide des composés
phénoliques est adoptée par l'acétate d'éthyle. Les
échantillons des margines sont mélangés avec
l'acétate d'éthyle (V/V). Le mélange est vigoureusement
agité et centrifugé à 3000 tours/min pendant 5 minutes. La
phase
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Matériel et Méthodes
organique est séparée et filtrée par une
seringue à filtre (0,45 uM). Le filtrat est analysé directement
par CLHP pour une détermination qualitative et quantitative des
composés phénoliques.
II-7 Analyse par Chromatographie liquide à haute
performance : CLHP
II.7.1. Analyse des monomères phénoliques
Le suivi de la concentration des molécules de
monomères phénoliques contenus dans les margines est
réalisé par chromatographie liquide à haute performance
(CLHP). Les composés sont identifiés et quantifiés par la
comparaison du temps de rétention et des aires des pics avec des
échantillons standards.
II.7.2. Analyse des masses moléculaires de
polyphénols
Le suivi de la variation des masses moléculaires de
polyphénols contenus dans les margines est réalisé par
chromatographie liquide à haute performance (CLHP) en utilisant une
colonne TSK-G2000 S-W-Supelco de longueur égale à 300 mm et de
diamètre intérieur de 7,5 mm avec un débit de 0,6 ml/mn.
La chaîne utilisée est de type Shimadzu. Elle comprend :
- Une pompe de type «LC-6A»;
- Un détecteur de type «UV-SPP-6AV» fixé
à une longueur d'onde égale à 280 nm; - Un
intégrateur de type «CR-6A»;
- Un injecteur de type «Rhéodyne 7125».
Comme phase mobile nous avons utilisé le tampon
phosphate 0,1 M à pH 6,8. Ce tampon contient 0,5 g/l de NaN3
(conservateur) et 0,1 M de Na2SO4 (déshydratant). Le débit est de
1 ml/min. Avant l'injection, l'échantillon est filtré sur
membrane « Millipore » de 0,45 ìm, puis dégazé
sous l'hélium. Les composés aromatiques sont
détectés à une longueur d'onde de 280 nm moyennant un
détecteur UV (Shimadzu class-VP).
II-8 Détermination de l'activité
antiradicalaire
II-8-1 Principe de la méthode
Cette méthode met en oeuvre un radical stable : 1,
1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl radical (DPPH). Ce radical peut fixer un (H°)
arraché à l'antioxydant (AH). Il perd alors son absorbance
à 520 nm et on calcule, après établissement de
l'état stationnaire de la réaction, la quantité
d'antioxydant nécessaire pour faire disparaître 50 % du DPPH
(Brand-Williams et al., 1995). L'avantage de ce test est d'être rapide (2
à 6 heures) et de ne nécessiter aucune condition drastique.
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Matériel et Méthodes
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