Memoire Online - Bioconversion enzymatique des composés phénoliques des effluents issus de l'extraction d'huile d'olive: une voie prometteuse de valorisation par la production de l'hydroxytyrosol naturel

L'utilisation des préparations enzymatiques commerciaux dans le processus d'extraction d'huile d'olive pour augmenter la concentration de composés phénoliques dans la pâte et l'huile pendant les étapes de malaxation a été approuvée par Garcia et al., 2001. De plus plusieurs recherches identifient les margines comme une source potentielle du récupération de composés phénoliques (Allouche et al., 2004; Aldini et al., 2006). Dans notre étude, l'acétate d'éthyle a été utilisé pour extraire des composés phénoliques des margines. Les analyses quantitatives et qualitatives de ces composés phénoliques ont été effectuées moyennant la chromatographie liquide haute pression : CLHP. La Fig. 26a illustre les chromatogrammes de CLHP de l'extrait à l'acétate d'éthyle des margines brutes et fraîches (le contrôle). Ce profil montre que les margines fraîches sont riches en oleuropéine (le pic 3) et un autre composé de verbascoside non identifié (le pic 4). Des composés bio-actives phénoliques simples comme HT (le pic 1) et tyrosol (le pic 2) sont aussi présents à de faibles concentrations. La concentration de l'hydroxytyrosol est de 0,049 g/l. Ce contenu correspond à la fraction libre en hydroxytyrosol dans les margines brutes fraîches. Cependant, les margines sont une source hydrolysable de phénols comme l'oleuropéine, les ligstrosides ou les verbascosides (Bianco et Uccella, 2000), dans lesquelles les principaux composants phénoliques sont des glycosides et des esters. Par conséquent, de grandes quantités de constituants phénoliques seraient libérées quand l'hydrolyse chimique ou enzymatique est survenue dans les margines, particulièrement les orthodiphénoliques comme l'hydroxytyrosol qui est reconnu par ces propriétés antioxydantes. L'analyse enzymatique montre que les margines brutes contiennent une activité â-glucosidase de 80 UI/ml (Tableau 10). Cette enzyme peut provenir du fruit : l'olive (Jemai et al., 2009) et aussi des activités des microorganismes (Ciafardini et Zullo, 2000). Cette concentration d'enzyme (aussi bien que d'autres enzymes hydrolytiques) n'est pas suffisante pour l'hydrolyse des conjugués cités et c'est pourquoi la concentration de l'hydrytyrosol augmente avec le temps de stockage des margines, suite à la fermentation spontanée et l'enrichissement de ces effluents en hydroxytyrosol (Fki et al., 2005). Ici, nous suggérons d'augmenter la concentration de ce composé bioactif par un traitement enzymatique tout en utilisant le jus de culture des champignons comme un processus d'intensification.

Figure 26 : Chromatogramme HPLC des composés phénoliques de la fraction d'acétate d'éthyle (détection à X = 280 nm) extraits de margines fraîches et brutes (a) et margines après son hydrolyse par B-glucosidase purifiée (b) et par les préparations enzymiques collectés suite à la fermentation du son de blé par le A. niger au dixième jours (c), T. atroviride au quatrième jour (d) et dixième jour (e) et T. trogii dixième jour (f) de culture. 1 : hydroxytyrosol; 2 : tyrosol; 3 : oleuropéine; 4 : composé non identifié.

Des jus d'enzymes fongiques obtenus par les cultures de A. niger, T. atroviride et T. trogii cultivé sur le son de blé ont été annoncés précédemment (Chapitre II : II-2) pour leur richesse d'enzymes spécifiques. Pour étudier l'effet de chaque préparation enzymatique à la libération de composés phénoliques simples des margines, les filtrats de jus de culture des

trois champignons ont été testés pour l'hydrolyse des margines pendant 2.0 h à 50 °C. Les jus de culture de ces champignons seront choisis en termes de leur spécificité en enzymes pour la transformation en composés orthodiphénoliques les substrats conjugués des margines. La Fig. 27 donne l'évolution de la concentration en hydroxytyrosol hydrolysée dans les margines par les jus extracellulaires fongiques récupérés à différent temps d'incubation des cultures. Comme c'est indiqué de cette figure, les quantités significatives en hydroxytyrosol ont été libérées après les différentes hydrolyses enzymatiques des margines.

Figure 27 : Evolution de la concentration de l'hydroxytyrosol dans la fraction phénolique récupérer à partir des margines après son hydrolyse par les jus extracellulaires collecté durant la fermentation sur son de blé par les trois souches.

L'étude quantitative des extraits de margines suite à son hydrolyse permet de présenter les chromatogrammes de HPLC résumé sur la Fig. 26. D'après cette figure on note une augmentation de l'intensité du pic de l'hydroxytyrosol (1) avec une diminution concomitante du sommet de l'oleuropéine (3) pendant la réaction de bioconversion des margines par les trois types de préparation d'enzyme. L'identification de l'hydroxytyrosol a été aussi confirmée par l'analyse LC-MS (chromatographie liquide couplée à la masse spectrale) (Fig.28). Les concentrations les plus élevées en hydroxytyrosol ont été obtenues en présence de jus de culture d'A. niger. La concentration en ce composé dans les margines a augmenté avec l'âge du jus de culture du A. niger qui pourrait être en corrélation avec la concentration des enzymes extracellulaires hydrolytiques comme l'activité B-glucosidase dans le jus de culture. La bonne corrélation entre la haute activité â-glucosidase et la libération de l'hydroxytyrosol dans les margines pourrait être observée (Fig. 25 et 27) pour les trois souches. Ces résultats peuvent confirmer que la â-glucosidase joue un rôle biochimique

significatif dans l'hydrolyse catalysant des liaisons glycosidiques dans les oligo et les polysaccharides présents dans les margines. L'activité estérase mesurée dans les trois jus de cultures a montré des activités qui varient entre 100-200 UI/ml (Fig. 25). Cette enzyme permet l'hydrolyse de la liaison ester entre les composés phénoliques et les polysaccharides. L'oleuropéine est un ester héterosidique de l'acide élenolique et l'hydroxytyrosol B-glucosylée. Ainsi, l'hydroxytyrosol peut être provenu de l'oleuropéine, via l'aglycone, par la libération de l'acide elénolique avec un réarrangement final dans le composé de secoiridoides (Walter et al., 1973). Ce résultat est en accord avec des études précédentes de Capasso et al., 1999 ; Briante et al., 2002.

		^{125 150}		¹⁷⁵	²⁰⁰	²²⁵	²⁵⁰	^{275 300 m/z}
^x106	^3.							^{-MS2(152.9), Line, 2.3-2.4min (#82-#86), 100%=1017523}
^1.0			^123.0					b
^0.8
^0.6
^Intens. ^0.4
^0.2
	^109.0
^0.0

Figure 28: Spectre de masse du l'ion total du pic chromatographique du temps de rétention
2,2 min dans les margines hydrolysées: (a) MS et (b) MS².

La concentration maximale de l'hydroxytyrosol enregistré par l'analyse CLHP était de 1,1 ; 0,5 et 0,2 g/l respectivement en présence des jus de culture d'A. niger du jour 10 (6380,95 UI/ml d'activité â-glucosidase), T. atroviride du jour 4 (365 UI/ml d'activité â-glucosidase) et T. trogii du jour 2 (29,05 UI/ml d'activité â-glucosidase). Ces concentrations sont 21,63 ; 10,2 et le 4,08 fois plus élevé que le contrôle (Tableau 12) si l'on utilise les jus de culture d' A. niger, T. atroviride et T. trogii respectivement. On a également observé une

augmentation de tyrosol dans le cas du T. atroviride (de 0.05 g/l à 0.17g/l) (Fig. 26e). Ce résultat montre que les enzymes de T. artroviride sont également actives sur des polymères contenant le tyrosol en tant qu'antité phénolique tel que le ligostroside. Cependant, l'utilisation du jus de culture de T. artroviride qui a montré des activités modérées de 3-glucosidase et de laccase a eu comme conséquence la diminution de la concentration de HT des margines (de 0.5 à 0.03) à la fin de la fermentation (Fig. 25e). Cette dégradation est expliquée par l'oxydation de HT par la laccase qui est très sensible aux agents oxydants que le tyrosol (Chakroun et al., 2010). L'utilisation de jus de culture de T. trogii qui a montré de forte activité laccase a abouti à la diminution de la concentration des composés phénoliques totales (Fig. 25c et 26f). Ces résultats montrent que la laccase est efficace pour la transformation ou l'oxydation de composés phénoliques simples et complexes et peut être considéré comme un outil efficace pour la désintoxication de déchets phénoliques comme les margines. La transformation oxydative de mélanges phénoliques naturels et synthétiques par la laccase de Trametes versicolor a été aussi examiné par Canfora et al., 2008.

De la présente partie d'étude, nous pouvons conclure que la margine est une source des phénols hydrolysables tels que l'oleuropéine, le ligstroside ou le verbascoside, qui présentent des liens glucosidiques et ester entre les principaux composants de phénol et les polysaccharides et/ou la lignine (Bianco, et Uccella, 2000 ; Walter, et al., 1973). En conséquence, une quantité plus élevée de HT est libérée quand l'hydrolyse enzymatique est produite dans la margine en employant la préparation enzymatique spécifique.

Des expériences de bioconversion en employant la 3-glucosidase purifiée par d'A. niger (EC 2328898),l'estérase purifiée et le viscozyme ont été conduits aux mêmes conditions opérationnels. Ces préparations enzymatiques ont été ajoutées aux margines à des proportions donnant une concentration en 3-glucosidase et éstérase de 1500 UI/ml au milieu réactionnel. L'utilisation de la 3-glucosidase pure d'A. niger (CE 2328898) UI/ml a abouti à l'obtention de 1,15 g/l d'hydroxytyrosol. Cette valeur est largement proche à celle obtenue en utilisant le jus de culture d'A. niger brute obtenue sans aucune étape de purification (Fig. 29). Cependant, l'augmentation du contenu en orthodiphénol utilisant la 3-glucosidase d'A. niger pure pendant la biotransfomation des margines peut rappeler beaucoup d'études qui ont utilisé cette enzyme pour l'hydrolyse de l'oleuropéine pure (Ciafardini et Zullo, 2000), ou les extraits de feuille d'Olea europaea (Briante, et al., 2002) ou dans des olives vertes (Walter et al., 1973). En revanche, l'estérase pure seule n'a aucun effet sur la bioconversion et la modification des composés phénoliques des margines.

La figure 29 montre également l'effet du viscozyme sur la libération de HT dans les margine. Cette dernière montre que le viscozyme est le meilleur biocatalyseur utulisé, il a augmenté la concentration d'HT de 0,05 (contrôle) à 1,15 g/l. Ceci peut être expliqué par la composition multienzymatique de cette préparation enzymatique commerciale, qui contient des cellulases, des arabinases, des hémicellulases, des gluconases et des xylanases, capable d'agir sur un grand nombre de composants, agit fondamentalement sur les substrats solubles et insolubles (Duenas et al., 2007), et ceci cause des modifications de plusieurs composés phénoliques et peut libérer des composés phénoliques plus simples. Ces résultats ont indiqué que la préparation enzymatique d'A. niger a le même effet que le viscozyme et la 3-glucosidase purifiée pour la libération d'HT. Alors que l'estérase n'a pas d'effet sur la bioconversion. Par conséquent, A. niger, généralement identifié comme le micro-organisme `'generally recognised as a safe (GRAS)», est un excellent producteur de la 3-glucosidase, qui est l'enzyme hydrolytique principale pour le monomerisation des polyphénols des margines. Par conséquent, la préparation enzymatique d'A. niger est la meilleure alternative pour augmenter le contenu de HT dans les margines par l'intermédiaire de la propre réaction de la bioconversion. De plus, la préparation enzymatique d'A. niger est exempt de laccase qui est une enzyme oxydante pour les composés phénoliques. Une concentration élevée de HT 1,1 g/l a été obtenue après 2 heures de réaction enzymatique des margines en présence de préparation enzymatique d'A. niger à 50 °C, et à pH 4,8 et en état statique. La concentration obtenue de HT par cette méthode de bioconversion peut être améliorée par l'optimisation d'autres paramètres : concentration en enzymes, état d'agitation, temps de réaction... etc.

Figure 29: Concentration maximale de l'hydroxytyrosol libéré à partir de margines traités par
la 3-glucosidase pure d'A. niger, viscozyme, la préparation enzymatique d'A. niger, estérase
pure et le contrôle.

Selon les travaux précédents (Espin et al., 2001 ; Bouallagui et Sayadi 2006 ; Capasso et al., 1999 ; Briante et al., 2002), des procédures de synthèse pour la production d'HT sont

chers et/ou ont des rendements bas en produit. Pour l'application à grande échelle du bio-processus proposé, 1 m³ de margine a eu comme conséquence la production de 1,1 kilogramme de HT. Le calcul du coût préliminaire d'hydrolyse des margines par la préparation enzymatique d'A. niger donne une valeur très intéressante des 1181,5 DT/m³. Par conséquent, ce bio-processus a pu ouvrir une nouvelle méthodologie possible pour récupérer un rendement élevé d'HT à bas pris.

Bioconversion enzymatique des composés phénoliques des effluents issus de l'extraction d'huile d'olive: une voie prometteuse de valorisation par la production de l'hydroxytyrosol naturel

II-3 Hydrolyse enzymatique des composés phénoliques des margines