III.2.2.Détermination de la Concentration
Minimale Inhibitrice et
20
(CMI) et de la Concentration Minimale Fongicide (CMF)
20
IV. Etude des activités enzymatiques
IV.1. Détermination de l'activité de la
phospholipase .. 20
IV.2. Détermination de l'activité de
l'aspartylprotéase secrétée ..... 21
IV.3. Détermination de l'activité de
l'estérase . 21
IV.4. Etude de pouvoir hémolytique . 22
IV.5. Identification des enzymes par les galeries Api ZYM ..
22
V. Etude qualitative et quantitative de
l'adhésion des souches de
Candida isolées .. 23
V.1. Etude qualitative de l'adhésion
24
V.1.1. Coloration à la safranine .
24
V.1.2. Production de « slime » sur gélose
préparée au rouge Congo. 24
V.2. Etude quantitative de l'adhésion
24
V.2.1. Test de hydrophobicité 24
V.2.2. Adhésion des Candida spp. sur les
plaques en polystyrène 25
Résultats
I. Caractérisation phénotypique des
espèces de Candida spp.
isolées 27
1. Etude morphologique . 27
1.1. Caractéristiques macroscopiques
27
1.2. Caractéristiques microscopiques
28
2. Différentes espèces de Candida spp.
Isolées à partir de la station
de traitement des lixiviats de Djebel Chakir
29
3. Test de floculation 30
4. Test de résistance à l'acide borique
31
II. Activité antifongique 31
1. Méthode de diffusion de disque
31
1.
31
Méthode de diffusion de disque
2. Détermination de la Concentration Minimale
Inhibitrice (CMI) et
de la Concentration Minimale Fongicide (CMF) .
33
III. Etude de la virulence des différentes
espèces de Candida spp. 33
isolées .
1. Détermination de l'activité de la
phospholipase . 33
2. Détermination de l'activité de
l'aspartylprotéase secrétée 33
3. Détermination de l'activité de
l'estérase 34
4. Etude de pouvoir hémolytique
34
5. Identification des enzymes par les galeries Api ZYM
36
IV. Etude qualitative et quantitative de
l'adhésion des souches
de Candida spp. Isolées .
37
1. Etude qualitative de la formation de biofilm .
37
1.1. Coloration à la safranine ..
37
1.2. Culture sur milieu au rouge Congo .
37
2. Etude quantitative de la formation de biofilm
38
2.1. Test de hydrophobicité 38
2.2. Sur les plaques en polystyrène .
38
Discussion 45
Conclusions générales 46
Références bibliographiques
Liste des Abréviations
A : Absorbance
AmB : Amphotéricine B
BSA : Sérum Bovine Albumine
C. albicans : Candida albicans
CDR: Candida Drug Resistance
CMI: Concentration minimale inhibitrice
CMF: Concertations minimale fongicide
CVV: Candidose vulvo-vaginale
DCO: Demande Chimique en Oxygène
SDD: Susceptibilité Dose Dépendante
DMSO: Diméthyl Sulfoxyde
DO: Densité Optique
ELISA: Enzyme-linked Immunosorbent Assay
Fe2+ : Fer
h : heure
MDR: Multi Drug Resistance
min: minute
Mg2 + : Magnesium
MgSO4:
Mm: Millimolaire
MTT: Bromure de
3-[4,5-diméthylthiazol-2-yl]-2,5-diphényltétrazolium
NaCl : Chlorure de soduim
Na2HPO4 : sodium déshydrogénophosphate
nm: Nanomètre
PBS : Phosphate Buffer Saline
PZ: Activité enzymatique
R: Résistante
rpm : rotation par minute
S : Sensible
XTT:2,3-bis (2-méthoxy-4-nitro-5-sulfophényl)-5
[(phénylamino) carbonyl]-2H-tétrazoli
YNB: Yeast Nitrogène Base
YNBG : Yeast Nitrogène Base Glycose
YPD: Milieu de culture Yeast extact /peptone /dextrose
Liste des figures
Figure 1. Différentes formes de
croissance des Candida 8
Figure 2. Schéma d'un biofilm
formé aux surfaces polymérique 13
Figure 3. Photo aérienne du centre
d'enfouissement technique de Djebel-Chakir 15
et les bassins de stockage des lixiviats
Figure 4. Unité de traitement des
lixiviats de la décharge de Djebel- 16
Chakir
Figure 5. Les principaux morphotypes obtenus
sur milieu CHROMagarTM 27
Candida
Figure 6. Observation microscopique des
colonies de Candida sur gélose 27
Sabouraud - chloramphénicol
Figure 7. Observation microscopique des
cellules de Candida colorées à la 29
fushine au microscope optique (G×100)
Figure 8. Détermination des
diamètres des zones d'inhibition de la croissance des
levures sur milieu Mueller-Hinton-Glucose-Bleu de
31
Figure 9. Aspect de l'activité de la
phospholipase sur gélose à base de jaune 33
d'oeuf
Figure 10. Différents exemples de
l'activité de la protéase obtenue sur gélose à
34
base de BSA .
Figure 11. Aspect des colonies ayant un
pouvoir hémolytique de type â sur gélose
34
à base de sang de mouton .
Figure 12. Formation de biofilm par la
méthode de coloration à la safranine 37
1%
Figure 13. Dégradation de la couleur
des souches de Candida cultivées sur des 37
boites contenant le rouge Congo
Figure 14. Distribution des valeurs de
l'absorbance de XTT (a) à 492 nm et du 41
cristal violet à 595 nm ..
Liste des tableaux
Tableau I. Caractères enzymatiques
étudiés sur les galeries Api Candida............
18
Tableau II. Caractères enzymatiques
étudiés sur les galeries Api Zym .. 23
Tableau III. Couleur des isolats obtenus sur
milieu CHROMagarTM Candida en
fonction de l'origine d'isolement . 28
Tableau IV.
Différentes espèces de levures isolées à
partir de la station de
29
...
traitement des lixiviats de Djebel Chakir
Tableau V. Origine, forme et caractères
biochimiques des levures isolées et
testées par les galeries Api
Candida...............................................................
30
Tableau VI. Résistance phénotypique
des différentes souches test l'amphotéricine
B 32
Tableau VII. Activités enzymatiques
(phospholipase, estérase et aspartylprotéase)
et pouvoir hémolytique des différentes souches
isolées 35
Tableau VIII. Caractères enzymatiques des
différents isolats de levures obtenus
sur la galerie Api Zym 36
Tableau IX. Etude qualitative de la production
d'exopolysaccharides par
coloration à la safranine 1% 39
INTRODUCTION
1
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