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Modélisation spatiale hiérarchique bayésienne de l'apparentement génétique et de l'héritabilité en milieu naturel à  l'aide de marqueurs moléculaires


par Ciré Elimane SALL
Université Montpellier II - Doctorat 2009
  

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ADN et marqueurs génétiques

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deux brins et chaque brin est constitué de l'enchaînement précis de quatre éléments de base, les nucléotides (cf Figure 1) (Boichard et al., 1998). Ces nucléotides diffèrent selon la base azotée qu'ils contiennent : l'adénine notée A, la guanine (G), la thymine (T) et la cytosine (C). Les successions des nucléotides sur les deux brins sont complémentaires (la base C est complémentaire à la base G et la base T est complémentaire à la base A). Cette succession des nucléotides constitue la séquence de l'ADN. Un marqueur génétique se

FIG. 1 - Structure d'une molécule d'ADN

trouve à des endroits précis du génôme et est dans la suite synonyme de locus marqueur; un locus marqueur est un locus polymorphe dont le génotype renseigne sur le génotype d'un ou de plusieurs locus voisin(s) (De Vienne, 1998). Un marqueur génétique de qualité "idéale" est :

1. polymorphe, c'est à dire qu'il possède plusieurs allèles;

2. co-dominant, c'est à dire un locus pour lequel tous les allèles présents peuvent être simplement déduits de l'observation du phénotype; l'hétérozygote peut être distingué de l'homozygote au locus;

3. non-épistasique, c'est à dire qu'il n'y a pas d'interaction inter-locus; le génotype en un locus est indépendant du génotype aux autres locus;

4. neutre, une substitution des allèles au locus marqueur n'a pas d'autres effets phénotypiques que ceux qui permettent de déterminer son gé-

notype; un marqueur neutre révèle directement les modifications géné-
tiques qu'elles se traduisent ou non par une modification phénotypique;

5. insensible au milieu, le génotype peut être déduit du phénotype indépendamment du milieu.

Les plus courants des marqueurs génétiques sont les marqueurs biochimiques, les marqueurs morphologiques et les marqueurs moléculaires. Mais le plus souvent, ce sont les marqueurs moléculaires qui ont, pour la plupart, toutes les qualités citées ci-dessus, au moins lorsque les techniques appropriées sont mises en oeuvre (De Vienne, 1998). Les marqueurs moléculaires permettent une caractérisation du génome de manière fiable, spécifique et rapide. Ainsi, nous nous intéresserons essentiellement, dans la suite, aux marqueurs moléculaires. Les marqueurs microsatellites ou SSR (Simple Sequence Repeats) sont des séquences constituées de répétition en tandem (toujours dans le même sens) d'un à quatre nucléotides répétés de 10 à 20 fois en moyenne. Par exemple, (A)Th , (TC)Th, (TAT)Th et (GATA)Th avec ii le nombre de répétitions, sont des marqueurs microsatellites couramment observés. Très nombreux et bien répartis sur le génome, les microsatellites se caractérisent par un important polymorphisme dû à la variation du nombre de répétitions selon les allèles (Boichard et al., 1998). Il s'agit ainsi d'un polymorphisme du nombre d'unités de répétitions et l'importance de ce polymorphisme constitue l'intérêt des marqueurs microsatellites. Les microsatellites sont des marqueurs dits multialléliques, c'est à dire qu'ils permettent de révéler une série de plusieurs allèles par locus. Les locus ainsi mis en évidence sont le plus souvent codominants et les deux allèles homologues sont observables chez un individu hétérozygote. Pour que le marqueur microsatellite puisse être repéré sans ambiguïté , il doit être entouré de part et d'autre par des séquences flanquantes uniques, appelées amorces, permettant d'identifier le locus. En effet, bien qu'un microsatellite donné ne soit pas spécifique d'un locus, les séquences flanquantes par contre le sont et une paire d'amorces spécifiques de ces régions flanquantes n'amplifiera que ce microsatellite. Ainsi, puisque les séquences des régions flanquantes sont généralement identiques pour les individus d'une même espèce, un locus microsatellite particulier peut souvent être identifié par ses séquences flanquantes (Selkoe et Toonen, 2006).

La mise en évidence du polymorphisme du marqueur est réalisée par l'amplification par PCR (Polymerase Chain Reaction) de la séquence entourant le microsatellite puis par électrophorèse sur gel d'acrylamide dont la haute résolution permet de distinguer des allèles dont la taille diffère de deux bases seulement (Boichard et al., 1998). La PCR, réaction de polymérisation en chaîne, est un procédé de biologie moléculaire permettant d'amplifier in vitro une zone spécifique de l'ADN (la séquence cible) comprise entre deux

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amorces connues. Cette technique permet, grâce a l'utilisation de l'enzyme polymérase qui résiste a de très hautes températures (thermo-résistante) et des amorces spécifiques, de multiplier par un facteur 2 le fragment d'ADN cible a chaque cycle et de le rendre ainsi facilement détectable après un certain nombre de cycles. Chaque cycle est constitué des trois étapes suivantes effectuées chacune a une température bien précise :

1. dénaturation; la dénaturation de l'ADN a 94° consiste a dissocier les deux brins d'ADN (rupture des liaisons hydrogènes entre les deux brins);

2. hybridation; la température est abaissée rapidement durant 45s a une température définie selon le type d'amorce et ainsi les amorces hybrident sur leur brin complémentaire;

3. élongation; une hausse rapide de la température a 72° durant 1 mn permet a l'enzyme polymérase (la Taq polymérase) d'ajouter des nucléotides aux amorces hybridées en respectant la complémentarité des bases.

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