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Analyse de la diversité des champignons ectomycorhiziens et des ectomycorhizes du raisinier bord de mer (Coccoloba Uvifera l.) le long d'un gradient de salinité en forêt littorale

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par Raymond AVRIL
Université des Antilles et de la Guyane - Master 2 2009
  

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3. Caractérisation moléculaire des MT et des sporophores

L'utilisation d'outils moléculaires (PCR -RFLP et séquencage) s'était avérée indispensable pour relier, d'une part les MT aux sporophores, et, d'autre part, identifier les sporophores aux MT.

Ë partir de 170 échantillons d'ECM collectées au niveau des arbres-mères et de leurs plantules le long du transect, l'amplification de l'ITS n'a été possible que pour 145 d'entre eux. Les tailles des régions ITS amplifiées sont comprises entre 600 et 1183 pb et s'avèrent peu variables pour discriminer les champignons (Figure 14).

Figure 14. Produits de l'amplification par PCR de la région ITS de l'ADNr de morphotypes. Puits: 1, 4 et 9= bcf ; 2 et 8= bff; 3= bbl ; 5= bcc; 6= pas d'amplifiat ; 7= bp; 10= témoin négatif; Mq, marqueur de poids moléculaire (1kb).

Parmi les enzymes de restriction préalablement testées (TaqI, HaeIII et HinfI), l'enzyme Hinf I a été retenue parce qu'elle a généré plus de bandes de restriction (résultats non montrés). La digestion des amplifiats des différents MT par HinfI a généré entre un et trois fragments de restriction de tailles différentes (Figure 15). On a ainsi caractérisé 6 ribotypes (A, B, C, D, E et F) pour 9 MT décrits (Tableau 5). La diversité des MT ne correspond donc pas à celle des ribotypes.

Parmi les 6 ribotypes, 4 (A, B, C et D) ont présenté des profils RFLP identiques aux 4 espèces de sporophores récoltées. Les ribotypes A, B, C et D correspondent respectivement à S. bermudense, R. cremeolilacina, C. cinnabarinus et I. xerophytica. L'identification moléculaire, basée sur la comparaison des profils RFLP, a été confirmée par le séquençage de l'ITS des mêmes échantillons. Par contre, les ribotypes E et F n'ont pas été reliés aux sporophores. Ces deux ribotypes ont été, cependant, identifiés à deux espèces de Tomentella par séquençage de l'ITS. Ce résultat n'est pas surprenant car on sait par ailleurs que les Tomentella fructifient rarement (Diédhiou et al., 2004). On n'a pas trouvé de MT correspondant aux champignons I. littoralis et A. arenicola dont les sporophores ont été pourtant récoltés le long du gradient. Il est possible que ces deux champignons aient formé très peu d'ECM. Il existe en effet des champignons comme Suillus qui fructifient abondamment mais forment très peu d'ECM (Smith & Read, 2008).

Figure 15. Produits de digestion par HinfI de la région ITS de l'ADNr des morphotypes. Puits : 1, 2, 3, 5 et 10= ribotype E ; 4 et 9= ribotype F ; 6= ribotype A ; 7 et 8= ribotype D ; Mq, marqueur de poids moléculaire (100 pb).

Il appara»t que les MT bcc, bp et bcf correspondent à un mélange de ribotypes. Par exemple, le MT bp est un mélange de 4 ribotypes. Ë l'inverse, un même ribotype peut correspondre à des MT différents. C'est le cas notamment du ribotype B trouvé chez 4 MT (bcc, mgcs, jpf et bp). En revanche, les MT bbl et jpp ont été, dans tous les cas, rattachés respectivement au ribotype A de S. bermudense et au ribotype C de C. cinnabarinus. Cette étude montre les limites du morphotypage pour identifier sans ambigu
·té la composante fongique des ECM et pour évaluer la fréquence des champignons observés sur les racines. Il est en effet bien connu que la couleur du manteau fongique peut changer en fonction de l'âge des MT, de la plante hTMte et de l'environnement (Diédhiou et al., 2004 ; Pestana Nieto & Santolamazza Carbone, 2009 ; Diédhiou et al., 2009). Le cas des

Tomentella est bien documenté à ce propos. Ces champ ignons ont la particularité de former des MT brun clair qui deviennent brun foncé au cours du vieillissement des racines de la plante hôte (B%o et al., 1991 ; Diédhiou et al., 2004).

Tableau 5. Polymorphisme de longueur des fragments de restriction de la région ITS (digestion par HinfI) des sporophores et des morphotypes ectomycorhiziens d'arbres-mères et de plantules de Coccoloba uvifera. (*) E= Tomentella sp2 ; F= Tomentella sp1.

Morphotype/ Sporophore

Taille

de l'I TS (pb)

Taille des fragments de restriction de l'ITS

(pb)

Ribotype

bbl

689

100, 270, 311

A

bcc

689

100, 270, 311

A

bcc

718

313, 392

B

bcc

738

346, 392

D

mcgs

718

315, 392

B

jpf

718

315, 392

B

jpp

1183

217, 433, 533

C

bp

689

100, 270, 311

A

bp

718

315, 392

B

bp

738

346, 392

D

bp

633

346

E*

bcf

633

346

E

bcf

655

165, 211, 308

F*

bfp

633

346

E

bff

655

165, 211, 308

F

S. bermudense

689

100, 270, 311

A

R. cremeolilacina

718

313, 392

B

C. cinnabarinus

1183

217, 433, 533

C

I. xerophytica

738

346, 392

D

I. littoralis

700

300, 400

G

A. arenicola

600

300

H

Le calcul de la fréquence des MT (Figures 12 et 13) reste approximatif pour certains MT (bcc, bp et bcf) constitués dÕun mélange de ribotypes. CÕest pourquoi il nous a paru intéressant dÕévaluer la fréquence de 6 ribotypes (Figure 16 et 17) pour avoir une estimation plus précise des différents champignons sur les racines. Les fréquences des ribotypes A, E et F sont globalement supérieures à celles des ribotypes B, C et D quel que soit le stade de développement de Coccoloba (Figure 16). Ces résultats sont en accord avec les fréquences des MT (Figure 13). S. bermudense, Tomentella sp1 et Tomentella sp2 sont majoritairement presents sur les racines des arbres-mères et leurs plantules en milieu peu salé. Ces trois champignons pourraient constituer des réseaux ectomycorhiziens potentiels reliant les arbres-mères et leurs plantules.

Figure 16. Frequence des six ribotypes (F, E, A, B, D et C) des arbres-meres et de leurs plantules en milieu peu sale.

En milieu sale, il y a moins de ribotypes quÕen milieu peu sale. Le ribotype A, rattaché à S. bermudense, a été plus frequent que les ribotypes F et B rattachés respectivement à Tomentella sp1 et R. cremeolilacina (Figure 17). On a vu aussi que parmi les 3 ribotypes, seul S. bermudense avait fructifié en milieu sale. Le cycle de reproduction sexuée de ce champignon serait adapté à la salinité.

Figure 17. Fréquence de trois ribotypes (A, B et F) des arbres en milieu salé.

Nous avons confirmé, au moins au niveau du genre, l'identification morphologique des sporophores et identifié la composante fongique des MT par le séquençage des régions ITS de l'ADNr nucléaire (Figure 18). L'analyse des séquences de l'ITS nous a permis aussi de confirmer l'analyse RFLP et de relier des MT aux sporophores. Sur l'arbre phylogénétique, on a distingué 8 groupes fongiques: C. cinnab arinus, A. arenicola, I. xerophytica, I. littoralis, S. bermudense, R. cremeolilacina, Tomentella sp1 et Tomentella sp2. Parmi les huit groupes, deux (A. arenicola et I. littoralis) ne présentent pas de MT, quatre (C. cinnabarinus, I. xerophytica, S. bermudense et R. cremeolilacina) sont reliés à des MT, et deux (Tomentella sp1 et Tomentella sp2) ne présentent pas de sporophores. Il y a une forte homologie entre les séquences de chaque groupe phylogénétique. Par exemple, les séquences des MT (AM100, P131, P118 et P81) montrent une forte homologie (100%) avec la séquence du sporophore (C19) de S. bermudense (Figure 18). Tout compte fait, la diversité des sporophores ne reflète pas la diversité des MT comme c'est le cas dans la plupart des régions tropicales (Rivière et al., 2007 ; Sanon et al., 2009 ; Diédhiou et al., 2009). La composition physico-chimique du sol étant relativement homogène le long du gradient, il est fort probable que la salinité participe en partie à la structuration des communautés de champignons ectomycorhiziens de C. uvifera. En effet, sur 8 groupes de champignons inventoriés, seules 3 espèces (S. bermudense, Tomentella sp1 et R. cremelilacina) ont été présentes à proximité du bord de mer et pourraient contribuer à l'adaptation de Coccoloba à la salinité. Yamato et al. (2008) ont montré à cet égard le rTMle important des MA dans la structuration des herbacées et des plantes rampantes en bordure de mer.

I

II

V

VI

VII

VIII

III

IV

Figure 18. Arbre phylogénétique basé sur le séquencage de l'ITS des huit taxons fongiques (I à VIII surlignés en jaune) de C. uvifera, comparé à des séquences de référence dans GenBank (en noir). Les valeurs de Ç bootstrap È sont indiquées au niveau des branches.

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