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Recherche de substances bio actives de centaurea microcarpa coss et dur.

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par Maroua FERHAT
Université de M'sila - Diplôme étude supérieur de biochimie 2009
  

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V.3. Extraction des flavonoïdes :

Les méthodes d'extraction des flavonoïdes dépendent aussi bien du matériel végétal que du type de flavonoïde à extraire. L'extraction proprement dite est réalisée par des solvants de polarité croissante. Un traitement préalable de la plante par un solvant apolaire (hexane ou éther de pétrole) la débarrasse des graisses, des stérols et des pigments (chlorophylle et caroténoïdes).un solvant chloré, le benzène, l'acétate d'éthyle ou l'éther diéthylique permet de récupérer les aglycones libres peu moyennement polaires. L'acétone, le méthanol, l'eau ou leur mélanges permet d'extraire les aglycones polyhydroxylés et la plupart des glycosides.

Les rendements d'extraction dans toutes les fractions flavonoidiques à partir de Centaurea microcarpa Coss et Dur. sont exprimées en pourcentage de matière sèche (%Ms) dans le tableau 13

Tableau 13: Rendement en flavonoïdes totaux de Centaurea microcarpa Coss et Dur.

1 ENuU- 43I l'exNrEIN 7 IP S1prENu11143'1pIESRrENiRn Rendement (%)

Extrait choloroformique 45 C 6,5925

Extrait d'acétate d'éthyle 45 C 7,0475

Extrait aqueux 45 C 14,536

Les résultats de l'extraction (figure19), selon la méthode de Makbary et Makhram (1982), montrent que Centaurea microcarpa Coss et Dur. contient différentes fractions de flavonoïdes. Les rendements obtenus varient entre et 14,536%

dont le meilleur est celui de l'extrait aqueux avec 14,536%, puis de l'extrait d'acétae d'éthyle avec 7,0475%, quant au plus faible est celui obtenu par l'extrait chloroformique avec un pourcentage de (6,5925%).

On remarque que les flavonoïdes extraits de l'espèce Centaurea microcarpa Coss et Dur.

sont beaucoup plus polaires qu'apolaires, ce qui explique le rendement élevées de l'extrait aqueux (14,536%) par rapport aux deux autres extraits, choloroformique et d'acétate d'éthyle, alors que les flavonoïdes apolaires sont mois présents, deux fois moins abondants que les flavonoïdes polaires, du fait du faible pourcentage obtenus avec l'extrait choloroformique.

L'ajout du chloroforme provoque la séparation des flavonoïdes en fractions glycosylées et aglycones, on constate que les flavonoïdes glycolysés sont plus abondants que les flavonoïdes aglycones car l'extraits cholorformique, dont le quels ils sont solubles, possède le plus faible rendement.

Rendement en flavonoides

16

14 12 10 8 6 4 2 0

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

Rendemant

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

Extrait chloroformiqueExtrait d'acétate d'éthyleExtrait aqueux

Figure 19: Rendement en flavonoïdes totaux chez Centaurea microcarpa Coss et Dur.

D'autre part, l'ajout de l'acétate d'éthyle, pour extraire les flavonoïdes mono et di -glycolysés, donne un rendement de (7,047%) inférieur à celui de l'extrait aqueux (14,536%) contient le reste des flavonoïdes, à savoir les di, tri et tétra glycosylés. Ce dernier montre la richesse de Centaurea microcarpa Coss et Dur. en flavonoïdes di, tri et tétra glycosylées par rapport au flavonoïdes mono et di glycosylés, ceci peut être expliqué par la grande solubilité des hétérosides, augmentant ainsi la polarité dans l'eau ce qui permet d'entrainer les flavonoïdes qui sont entrainés dans la phase aqueuse d'où leur présence dans l'extrait aqueux (figure20).

En outre, on observe la présence des flavonoïdes di glycosylées dans les deux extraits aqueux et l'acétate d'éthyle , du peu itre aux différences de masse molaires entre la partie hétérosidique et le reste du flavonoïdes (partie aglycone) ; si la partie hétérosidique du flavonoïde diglycosylées domine (son poids moléculaire est plus élevé par rapport a la partie aglycone) ce dernier sera plus soluble dans l'eau ,en l'occurrence, retrouvé dans l'extrait aqueux , alors que si la partie aglycone prédomine sur l'hétéroside, donnant ainsi une solubilité moins marqué au flavonoïde di glycosylée, ce dernier se retrouvera dans l'extrait d'acétate d'éthyle. On peu dire que la solubilité des flavonoïdes dépend aussi de la la fraction hétérosidique.

D'une manière générale, le protocole d'extraction des flavonoïdes de Centaurea microcarpa Coss et Dur. suivi montre que cette espèce est riche en flavonoïdes, dont ceux glycosylées (polaires) sont plus abondants que ceux non glycosylées (apolaires), possédant des degrés de solubilités très hétérogènes résultant de leurs différences de structure. En effet, les travaux de Mishiso et son équipe (2006), sur 80 espèces Centaurea démontre que ce genre botanique renferme des flavonoïdes, flavones et flavonols en grande majorités, et leurs dérivées glycosidiques.

25%

22%

53%

flavonoides di,tri et tetra glycosylées flavonoides mono et di glycosylées flavonoides aglycones

Figure 20: Répartition des différentes fractions flavonoides de Centaurea microcarpa Coss et Dur.

V.4. Extraction des HE :

Le rendement en HE est défini comme étant le rapport de la masse en HE sur la masse de la matière sèche végétale (partie aérienne), exprimé en % (P /P).

Les résultats de l'extraction par hydrodistilation, montrent que la plante d'étude posséde un pourcentage en HE, estimé à 1,213%(figure21).

La teneur en HE chez la nigelle (Nigella sativa L.) est de 0,03-0,04%, et celle de l'origan (Origannum glandulosum Desf.) atteint les 2,62% (Bousbia, 2004). On remaque que la teneur en HE de notre espèce se situe entre les deux pourcentages (1,213%) et prend une valeur moyenne.

En se référent aux études précédentes et en comparent le rendement obtenu chez Centaurea microcarpa Coss et Dur. avec d'autre espèces, on peu dire que cette espèce présente une teneur en HE moyenne.

1,213%

98,787%

matiére végétale séche HE

Figure21: Pourcentage en HE de Centaurea microcarpa Coss et Dur.

V.5. Caractérisation des extraits bruts polyphénoliques :

V.5.1. Recherche de quelques substances actives :

Les résultats des tests phytochimiques sont regroupés dans le tableau 14.

Les extraits de la partie aérienne de Centaurea microcarpa Coss et Dur. contient des PP, la phase aqueuse ayant viré au rouge après ajout du HCl.

L'anneau bleu ou bande bleu formé après ajout d'ammoniaque à l'infus, indique la présence d'anthocyanes.

D'après la coloration noire obtenue avec FeCl3, la partie aérienne de Centaurea microcarpa et Dur. contient des tanins galliques et catéchiques.

La formation de mousse après agitation de l'infus et l'eau distillé, et sa persistance après 15min de repos est due à la présence de saponosides dans la plante mais à un faible degré du car la hauteur de la mousse obtenus n'a pas dépassé les 0,3cm.

Après exposition aux vapeurs de NH3 et visualisation sous UV, les fluorescences jaunâtres observées, indique l'existence de coumarines.

Tableau 14: Résultats des tests phytochimiques.

Composée

PP

Anthocyanes

Tanins

Saponoside

Coumarine

Réactifs

HCl

NH4

Fe2Cl3

Eau distillé

NaOH

Présence

+

+

+

+

+

Coloration

Rouge

Bande bleu

Bleu nuit

0,3 cm

Jaune fluo

Photo :

Témoin Extrait

 

Témoin

 

Extrait

 
 

Témoin

Extrait

Témoin Extrait

 
 

V.6. Chromatographie sur couche mince (CCM) :

La chromatographie sur couche mince de silice qui est à la fois une méthode de séparation et d'identification de divers constituants d'un mélange. Pour ce qui est de notre analyse, on se sert de la CCM pour mettre en évidence les différentes familles de PP, en fonction de leur façon de migrer dans les conditions données. On à utilisées huit systèmes solvants de polarités différentes, en présence de deux substances standards ; la quercitine et l'acide gallique.

Les plaques CCM observées, après élution par les différents systèmes solvants, montrent des taches de nombres, de couleurs et de distances de migrations différents (figure15).

Chapitre V : Résultats et interprétations.

Tableau : Résultats de la CCM :

En se basant sur la comparaison des RF des standards et des taches de l'extrait méthanolique, la présence de GAE et de QER en même temps est confirmée dans les systèmes: SII, SIV, SVI, SVII et SVIII, dont les RF sont respectivement: 0,479, 0,875, 0,051, 0,82 et 0,76 pour GAE et sont 0,683, 0,927, 0,091, 0,87 et 0,853 pour QER.

En revanche, la présence de la quercétine seule est observée dans les systèmes SI, SIII et SV dont les RF sont respectivement: 0,466, 0,906 et 0,091. Ces trois systèmes n'ont pas permis l'élution de GAE cela est du à sa faible solubilité dans les solvants apolaires a cause de sa structure complexe et son poids moléculaire élevé (tableau 16).

Tableau 16: Propriétés physicochimiques des étalons utilisées en CCM.

Composés

Structure

Masse molaire(gmol-1 )

Famille

 

Quercétine

 

170,1195

flavonoïde

L'acide gallique

 

302,2357

Tanin

Les polyphénols sont une famille de composés très hétérogène 9000 composés, classés en 12 classes, dont la classe majeure est celle des flavonoïdes. Les tableaux 17 et 18 donnent les caractéristiques des composés phénoliques et des flavonoïdes observés sous UV après séparation par CCM.

Tableau 17: composés phénoliques identifiés par CCM (Markham, 1982).

Couleurs sous UV Composés probables

Rouge Anthocyanidine 3 glucoside

Rose Anthocyanidine 3,5 di glucoside

Orange Anthocyanidine 3 glucoside

Orange pale Anthocyanidine 3glucoside

Jaune Flavonols

Jaune pale Flavonols

Vert Rutine

Bleu sombre Flavonols, flavonones, aurones

Bleu vif Hydroquinones

Bleu pale Acide phénol

Bleu blanc fluo Acide phénol

Mauve Flavonols, flavonones, isoflavonones, flavones

Flavones

Violet Flavonols, flavonones, isoflavonones, flavone

Pourpre sombre chalcones.

Tableau 18: Révélation des flavonoïdes après séparation CCM (Markham, 1982).

UV 366 nm AlCl3/UV 366 nm Type de phénols ou flavonoïdes

Couleur Couleur

possibles.

Rouge
Jaune
Jaune pale
Bleu blanc fluo
Bleu blanc fluo

Pourpre sombre

Orange Orange Jaune pale orange Bleu clair

jaune

Anthocyanidine 3 glucoside
Flavonols
Falvonols
Acide phénolique
Flavonols, flavonones, flavones
Isoflavonones.

Flavonols, isoflavonones, flavones,
chalcones.

Après observation des plaques dans une chambre noire d'une CCM à haute performance (HPTLC, Camag) et en s'appuyant sur les données de la bibliographie quant à la séparation des composés phénoliques par CCM et leur observation sous UV (tableau 17 et 18) on peut éventuellement prédire les composés ou les familles de composés les plus probables qui peuvent entrer dans la composition de l'extrait méthanolique de Centaurea microcarpa Cross et Dur., l'ensemble des observations et des résultats sont regroupés dans le tableau 19.

Tableau 19: Composés phénoliques probables identifiés par CCM .

UV

Système 254nm spot 366nm Composés probables

SI 07 taches sombres S1 Marron foncé Pigments

S2 Marron foncé Pigments

S3 Rouge Anthocyanidine 3,5 di glucoside

Q Sombre

SII 04 taches sombres S1

S2

S3 Q

AG

Claire

Marron claire

Rouge

Orange

Vert bleu fluorescent

-

Pigments

Anthocyanidines 3,5 di glucosides

SIII 05 taches sombres S1 Bleu fluorescent Flavonols, flavonones, isoflavonone

Marron sombre flavones

S2 Pigments

S3 Orange foncé

S4 Orange foncé Anthocyanidine3 glucoside

S5 Orange foncé

Q Orange foncé

SIV 04 taches sombres S1

S2

S3

S4

S5

S6

S7

Q AG

Violet

Vert clair

Marron

Bleu fluorescent

Rouge

Violet

Vert clair

Rouge fluorescent
Violet fluorescent

Anthocyanidine3 glucoside Flavonols, flavones, aurones Pigments

Flavonols, flavonones, isoflavonone flavones

Anthocyanidine3 glucoside Anthocyanidine3 glucoside Flavonols, flavones, aurones

SV S1

S2

S3 Q

AG

Marron foncé Orange

Clair

Orange clair
Orange clair

Pigments

Anthocyanidine 3 glucoside

-

SVI Une seule tache sombre S1

S2

S3

S4

S5 Q

Orange clair Rose

Bleu

Orange

Orange clair Rose fluorescent

Anthocyanidine3 glucoside Anthocyanidine 3,5 di glucoside Acide phénol

Anthocyanidine3 glucoside Anthocyanidine3 glucoside Anthocyanidine 3,5 di glucoside

SVII 04 taches sombres S1

S2

S3

S4

S5

Vert jaunâtre Sombre

Vert jaunâtre Rouge

Clair

Flavonols, flavones, aurones Pigments

Flavonols, flavones, aurones Anthocyanidine3 glucoside -

Q Vert clair

AG Rose clair

SVIII 02 taches sombres S1

S2

S3

S4

S5

S6 Q

AG

Marron foncé Vert fluorescent Rose orangé Gris foncé

Clair

Clair

Orange foncé orange

Pigment

Flavonols, flavones, aurones

Anthocyanidine3, 5 di glucoside

-
-
-

D'après les résultats de ce tableau, le système qui a donné la meilleure séparation est celui de l'acétate d'éthyle/acide formique/eau (8/1/1, v/v/v), par ce qu'il a permis la séparation de 09 taches y compris les étalons, ce qui explique la solubilité différentielle des composés phénoliques dans le système IV.

.Observation sous UV à 254 nm:

A 254nm, le système SI a permis de séparer 07 taches sombres de taille moyenne et de forme plus ou moins circulaire, tan disque le système SIII n'a pu séparer que 05 taches sombres, par contre les systèmes SII, SIV, SVI et SVII ont permis la séparation de 04 taches de grandes tailles et de formes plus ou moins fusitives et les systèmes SII et SVIII n'ont permis que l'apparition d'une et de deux taches respectivement.

.Observation sous UV à 366 nm:

A 366nm, le système SI a permis le fractionnement de l'extrait méthanolique en 03 taches, présentant les couleurs: marron et rouge pouvant indiquer respectivement la présence des pigments et des anthocyanidines 3,5 di glucosides.

De même le système SII n'a permis que la séparation de 03 taches dont les couleurs sont: le marron clair, le clair et le rouge, correspondant respectivement à des pigments et à des anthocyanidines 3,5 di glucosides.

Après une simple comparaison entre le premier et le deuxième système, il apparaît clair et évident que la tache rouge, qui correspond aux anthocyanidines 3,5 di glucosides, est commune, et vue la présence du méthanol dans ces deux systèmes, on constate que le méthanol est le responsable de son élution.

Le système SIII a permis le fractionnement de l'extrait méthanolique en 05 taches de couleurs: bleu fluorescent, marron et orange foncé, pouvant indiquer respectivement la présence des flavonols et/ou des flavonones et/ou des isoflavonones et/ou des flavones, des pigments et des anthocyanidine3 glucoside.

Pour ce qui est du système SIV qui a donné 07 taches de couleurs : vert clair, marron, bleu fluorescent et rouge, le violet indiquant respectivement des Flavonols et/ou des flavones et/ou des aurones, des Pigments et des anthocyanidines 3 glucosides.Ce dernier système présente 02 taches communes avec le système précédent (bleu, marron), ce qui explique que l'acétate d'éthyle, présent dans les 02 systèmes SIII et SIV, est responsable de leur séparation.

Le système SV a permis le fractionnement de l'extrait méthanolique en 03 taches de couleurs: marron foncé, orange et clair correspondant respectivement à des pigments et des anthocyanidines3 glucosides.

Le tableau 14 montre que le système SVI a permis la séparation de 06 taches dont les couleurs sont : l'orange clair; le rose, le bleu, l'orange et le rose fluorescent, pouvant indiquer la présence des anthocyanidines 3 glucosides pour les couleurs orange et orange clair, les anthocyanidines pour le rose et le rose fluorescent et l'acide phénol pour le bleu.

La tache orange est commune dans les plaques éluées par les systèmes solvants SV et SVI, ce qui prouve que l'acétate d'éthyle est le responsable de sa séparation, tan disque, la tache marron est spécifique à l'éther di éthylique et les taches: rose, rose fluorescent, bleue sont spécifiques au dichlorométhane.

En outre, le système SVII a permis l'apparition de 05 taches, dont les couleurs sont: le vert jaunâtre, le sombre, le rouge et le clair pouvant indiquer respectivement la présence des flavonols et/ou des flavones et/ou des aurones, des pigments et anthocyanidine3 glucoside.

En fin, le système SVIII a permis la séparation de 06 taches dont les couleurs sont: le marron foncé, le vert fluorescent, le rose orangé et le gris foncé, correspondant respectivement à des pigments, des flavonols et/ou des flavones et/ou des aurones et des anthocyanidine3, 5 di glucoside.

Aprés l'analyse des résultats obtenus, la CCM confirme la présence et la richesse de la plante en poly phénols, en tanins et en flavonoïdes déjà mis en évidence préalablement par des tests phytochimiques. La bonne séparation apparaît dans les systèmes polaires prouve que les polypheols, les tanins et les flavonoïdes existants sont de nature beaucoup plus polaire.

V.7. Spéctrophotométrie UV-visible :

L'analyse spectrophopotométrique UV-visible de l'extrait brut méthanolique (figure22) indique la présence de quatre pics, de longueurs d'ondes et d'absorbances différentes, avec trois pics qui absorbent dans l'UV (pics 2,3 et 4) dont le plus élevé est le pic 4 (ëmax=203nm, Abs=1,0021) ; enfin, une faible valeur de l'absorbance est observé (0,0035) à 663nm.

L'absorption à des longueurs d'ondes différentes (de 203nm à 663nm) (figure21) indique la présence de familles de composées très variées, du point de vue structure chimique, présence de fonctions ou double liaisons.

Figure 22: Spectre d'absorption de l'extrait méthanolique obtenu par la méthode d'Owen et Johns, 19

L'analyse du spectre d'absorption de l'extrait brute méthanolique (tableau20) à permis de constater la différence de composition de l'extrait et le pouvoir d'absorption de ces composées, soit dans l'UV soit dans le visible.

Tableau 20: Résultats de l'analyse spectrale.

Les pics :

1

2

3

4

Longueurs d'ondes

663,00

341,00

268,50

203,00

Absorbance :

0,0035

0,1234

0,1997

1,0021

Une simple lecture du spectre montre que (Silverstein et al., 1998) :

· Le pic1 (663 nm) correspond à l'absorption des pigments chlorophylliens (a et b).

· Une absorbance à 341nm montre la présence de tryptophane et d'acides aromatiques.

· L'absorption à une longueur d'onde de 268,5 nm est due à la présence d'acides gras insaturées, d'ethylebenzéne et de certaines huiles.

· Le pic 4 indique la présence de benzène qui absorbe à 203nm.

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