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Recherche de substances bio actives de centaurea microcarpa coss et dur.

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par Maroua FERHAT
Université de M'sila - Diplôme étude supérieur de biochimie 2009
  

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Introduction :

Les plantes véritable usine chimique ne cessent de nous épater encore et encore par la richesse des constituants qu'elles synthétisent que par les multiples utilisations qu'elles trouvent dans notre vie quotidienne. Cela nous fait ouvrir les yeux sur la terre, sur sa végétation et sur les possibilités médicinales car malgré les énormes progrès réalisés par la médecine moderne l'homme n'a eu que les plantes pour le guérir et prévenir depuis la nuit des temps du fait que les plantes présentent des remèdes naturels bien acceptés par l'organisme .

La recherche sur les substances naturelles est un thème porteur de puis quelques années et les laboratoires pharmaceutiques sont toujours prêts à l'élaboration de nouveaux composés actifs, à l'identification, à la caractérisation des molécules naturelles et à la mise au point des médicaments qui ont pour origine des substances naturelles et de s'inspirer de leurs structures moléculaires pour imaginer de nouveaux médicaments. Ces molécules que constitue le principe actif des plantes médicinales appartiennent majoritairement aux métabolites secondaires tels que les polyphénols, les huiles essentiels et les alcaloïdes.

On s'est intéressé dans notre travail aux molécules ayant des propriétés antioxydantes. Dans ce cadre, on a étudié les extraits d'une espèce végétale ; Centaurea microcarpa Coss et Dur., suivant deux approches

- Une approche théorique visant:

· Présenter les polyphénols et les huiles essentielles de façon générale

· Mettre en avant les activités anti oxydantes des polyphénols et l'activité

antimicrobienne des huiles essentielles.

- Une approche expérimentale consistant à :

· Extraire des polyphénols, des flavonoïdes et des huiles essentielles par différents

méthodes et déterminer les différents facteurs qui influencent leur extraction ainsi que

les rendements.

(CCM) et une analyse spectrale par spectrophotométrie UV-visible.

· Soumaitre les extraits brutes polyphénoliques a une analyse chromatographique

Les polyphénols et

mJsXtJ IdJ Il'LF\ivité

antioxydante

I.1. Les polyphenols :

I.1.1. Définition des polyphénols:

Avec environ 9000 structures naturelles élucidées à ce jour, les polyphénols constituent une famille importante de métabolites secondaires de faible poids moléculaire du règne végétal (Akowah et al, 2004), qui correspondent à une très large gamme de structures chimiques et sont un bon témoin de l'extraordinaire capacité de biosynthèse des plantes. Ce sont des corps dont la molécule contient plusieurs fonctions phénols (Ferguson L, 2000), ces corps jouent un rôle fondamental car sont des éléments importants de qualités sensorielles (couleur et caractère organoleptique.) et nutritionnelles des végétaux que consomme l'homme et leur intervention dans la santé et maintenant reconnue dans des domaines variés,anticoncerigene ,antioxydant, la lutte contre le vieillissement des cellules (Sarni-Manchado et Cheynier,2006), anti oestrogenique et anti inflammatoire, certains d'eux sont dits non nutritionnels car ils ne jouent aucun rôle dans la plantes.

I.1.2 Localisation au niveau cellulaire et tissulaire:

Une bonne reconnaissance de la localisation des composés phénoliques dans les différents tissus et organes végétaux est souvent essentielle pour orienter l'utilisation que l'homme souhaite en faire.

A l'échelle cellulaire, la localisation des composés est très caracteristique.Ils s'accumulent principalement dans deux sites : d'une part la paroi cellulaire ou sont présentes les lignines et la

vacuole RX \RQ \tRFké\ O\ SNénRl\ \RlXRe\ [lntNRF l11\, KlMRnRl\, Ilnin\, I FRtlin\

flavonoïdes (quercétine, kamphérol) pourraient également être présents au niveau du noyau et de la membrane plasmique mais toujours à très faible concentration.

A l'échelle tissulaire, on observe également des repartions très inégales des différents composés phénoliques. Ainsi les anthocyanes et les pigments de type flavonols sont généralement présent dans les couches cellulaires externes des organes végétaux en particulier les épidermes de fruits et des feuilles.(Sarni et Cheynier ,2006).

=Répartition au niveau des fruits et légumes:

Plusieurs milliers de polyphénols ont été identifiés chez les plantes dont plusieurs centaines dans les plantes comestibles. Il est généralement admis que les humains ingèrent environ 1 gramme de polyphenols par jour (Akowah et al, 2004).

Tableau 01 : Classement des fruits et légumes les plus riches en polyphénols :
( Brad et al., 2008 )

 

Fruits et légumes

PP totaux ( mg GAE/100 g )

01

$ EtiFKIIIXtJ(JF IXEJI

321.3

02

Persil

280.2

03

Fraise

263.8

04

Choux de Bruxelles

257.1

05

Litchi

222.3

06

Raisin

195.5

07

Abricot

179.8

08

Pomme

179.1

09

Echalote

104.1

10

Datte

99.3

11

Brocoli

98.9

12

Cerise

94.3

13

Figue

92.5

14

Célerie

84.7

15

Oignon

76.1

16

Nectarine blanche

72.7

17

Fruit de passion

71.8

18

Poire

69.2

19

Mangue

68.1

20

Aubergine

65.6

60%

0% 0%

40%

légume fruits

Figure 01 : Répartition des polyphénols dans les fruits et légumes.

Les polyphénols sont particulièrement abondants dans les fruits. Leur teneur Peut atteindre 263.8. mg GAE / 100 g dans certains fruits comme les fraises, les pommes, les raisins.

Les légumes contiennent aussi des quantités importantes de PP. le champion toute catégories est l'artichaut avec une concentration de 321.3 mg GAE / 100 g.

Parmi les 20 premiers fruits et légumes les plus riches en polyphénols. 60 % représentent les fruits et le reste des 40 % est représenté par les légumes

q 11141 1 plKEdl-lafpWdl-f al-s SEOSKpnEC :

L'extraction, la séparation, la caractérisation et le dosage des composées phénoliques se fait selon plusieurs méthodes, les plus utilisées et employées sont résumé dans le tableau qui suit :

Tableau 02 : Principales méthodes d'études des composées phénoliques :

 

Techniques :

Principe:

Référence :

Extraction

Extraction par les

solvants (macération)

Le contacte entre le solvant(liquide) et la matière

végétale (solide) a pour but de libérer les polyphénols présents dans les cellules par rupture du tissus végétale et par diffusion.

Owen et johns, 1999

Hayouni et al.,2007

Extraction par

chromatographie sur

colonne

Elle consiste à absorber sur une résine du type C18 pour les polyphénols et flavonoïdes des extraits végétaux puis à éluer sélectivement les substances polyphénoliques au moyen d'éthanol ou méthanol aqueux .

 

Extraction supercritiques (SFE)

-Le CO2 supercritique, utilisé comme solvant

d'extraction, du fait de sa faible viscosité lui confère une grande capacité de diffusion lui permettant d'avoir accès à des composées phénoliques liés a la paroi cellulaire et sa densité relativement élevé lui confère un pouvoir de solvatation ce qui permet un meilleur taux d'extraction. -Procédé non dénaturant.

-Temps d'extraction réduit.

Chan et Maznah ,2009

Separation et purification

Chromatographie sur couche mince (CCM)

Séparation et purification des différents constituants en fonction de leur taille et de leur forme Les constituants du mélange se séparent par migration différentielle : chacun d'eux est d'autant plus entraîné par l'éluant qu'il est plus soluble dans celui-ci et

moins adsorbé sur la phase stationnaire.

Tissut, 1967

Chromatographie liquide haute
performance (HPLC)

L'échantillon à analyser est poussé par un liquide
(appelée phase mobile) dans une colonne remplie d'une

CastanedaOvando et al.,2009.

phase stationnaire de fine granulométrie (les "grains" sont de très petite taille). Le débit d'écoulement de la phase mobile est élevé ce qui entraîne une augmentation de la pression dans le système. Ce débit élevé diminue le temps nécessaire pour séparer les composants le long de la phase stationnaire

Chromatographie
phase gaz (CPG)

Les différents solutés gazeux vont se séparer par

migration différentielle le long de la phase stationnaire.

Colin-Henrion et al.,2008

Caracterisation

Chromatographie sur couche mince (CCM

Les constituants du mélange se séparent par migration différentielle : chacun d'eux est d'autant plus entraîné par l'éluant qu'il est plus soluble dans celui-ci et

moins adsorbé sur la phase stationnaire.

Lawson,2006

Spectrophotométrie UV-visible

méthode analytique quantitative qui consiste à mesurer l'absorbance ou la densité optique d'une substance chimique donnée en solution. Plus cette espèce est concentrée plus elle absorbe la lumière dans les limites de proportionnalités énoncées par la loi de Beer-Lambert. La densité optique des solutions est déterminée par un spectrophotomètre préalablement étalonné sur la longueur d'onde d'absorption de l'espèce chimique à étudier.

Harbourne et al.,2009

HPLC-MS et RMN

 

Bassomo et al.,2004

Dosage

Dosage par

spectrophotométrie

Par méthode de Folin ( non spécifique)

Harbourne et al.,2009

Dosage par HPLC

Séparation sur colonne phase inverse C18 et détection à l'aide d'un spectrophotomètre UV 171

Lawson,2006

².2. Les flavonoïdes

Les flavonoïdes présentent la plus grande classe de polyphénols, ils relèvent du métabolisme secondaire et sont très répondus dans le règne végétal. On estime que 2% de l'ensemble du carbone photo-synthétisé par les plantes est transformé en flavonoïdes (Alothmane et al.,2009).

Ils sont présent dans les feuilles, les fleurs, le pollen et les fruits, leur concentration augmente avec l'exposition au soleil et constituent de ce fait un écran protecteur contre la photo et la thermodégradation (protègent la plante des agressions du rayonnement UV) (Sarni-manchado et Cheynier, 2006). Ils participent aussi à la coloration des fleurs et des fruits et existent le plus souvent a l'état naturel sous forme d'hétérosides.

Les flavonoïdes sont des molécules polyphénoliques avec un squelette diphenylpropane (C6-C3- C6) (Alothmane et al., 2009), fait de 15 atomes de carbone, avec une grande diversité structurale, en effet, on en dénombre 5000 composés différents et présentant des propriétés de solubilités différentes influençant leurs extraction (Alothmane et al.,2009).

Plusieurs études ont soulignés que les flavonoïdes de différentes sources botaniques agissent comme antioxydants puissant encor plus que la vitamine C (Alothmane et al.,2009),

due principalement à la configuration catéchol du noyau B. Cette activité s'exerce surtout dans les milieux émulsionnés car ils sont peu solubles dans les phases lipidiques et protègent efficacement les lipoprotéines ou liposomes (Sarni-manchado et Cheynier, 2006). Les flavonoides agissent comme antioxydants primaires et stabilisent les radicaux peroxydes, mais peuvent aussi désactiver l'ion super-oxyde, le radical OH* ou l'oxygène singulet, inhiber la lipoxygénase ou encor chélater les métaux (surtout les flavonoïdes) (Sarni-manchado et Cheynier, 2006).

Figure 02: Squelette flavonoïdique ( C6-C3-C6)

Deux cycles aromatiques de type phényl A et B liés par une chaine de trois carbone généralement cycliques.

Le degré d'oxydation du cycle détermine les différentes classes de flavonoïdes

qiim Activités biologiques des polyphénols :

Les composées phénoliques sont douées d'activités diverses, probablement su a leurs diversités structurales, le tableau suivant, englobe les activités biologiques des polyphénols les plus importantes :

Tableau 03 : Principales activités biologiques des composées phénoliques :

Classes de polyphénols

Activités

Références

Acide phénoliques

Anti carcinogènes Anti mutagènes

Anti oxydants

Ferguson, 2001

Sarni-Manchado et Chenyier ,2006

Stilbénes

Inhibent l'oxydation des LDL et l'agrégation des plaquettes

Anti carcinogènes Anti mutagènes

Sarni-Manchado et Chenyier, 2006

Ferguson, 2001

Coumarines

Anti carcinogènes Anti mutagènes

Digestibilité des protéines

Ferguson,2001

Lazoui et al ,2006

Flavonoïdes

Anti carcinogènes Anti mutagènes

Anti oxydants

Ferguson, 2001

Alothane et al ,2009

Anthocyanes

Anti oxydants Colorants

Sarni-Manchado et Chenyier ,2006 Ferguson, 2001

Lignines

Anti carcinogènes Anti mutagènes

Ferguson,2001

Tanins

Anti oxydants Anti tumoral

Digestibilités des protéines

Mousavinejade et al. ,2009

Lazoui et al ,2006

Proanthocyanidines

Anti inflammatoires

Anti bactériens Anti fongiques

Ferguson,2001

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