Memoire Online - Recherche de substances bio actives de centaurea microcarpa coss et dur.

Les plantes véritable usine chimique ne cessent de nous épater encore et encore par la richesse des constituants qu'elles synthétisent que par les multiples utilisations qu'elles trouvent dans notre vie quotidienne. Cela nous fait ouvrir les yeux sur la terre, sur sa végétation et sur les possibilités médicinales car malgré les énormes progrès réalisés par la médecine moderne l'homme n'a eu que les plantes pour le guérir et prévenir depuis la nuit des temps du fait que les plantes présentent des remèdes naturels bien acceptés par l'organisme .

La recherche sur les substances naturelles est un thème porteur de puis quelques années et les laboratoires pharmaceutiques sont toujours prêts à l'élaboration de nouveaux composés actifs, à l'identification, à la caractérisation des molécules naturelles et à la mise au point des médicaments qui ont pour origine des substances naturelles et de s'inspirer de leurs structures moléculaires pour imaginer de nouveaux médicaments. Ces molécules que constitue le principe actif des plantes médicinales appartiennent majoritairement aux métabolites secondaires tels que les polyphénols, les huiles essentiels et les alcaloïdes.

On s'est intéressé dans notre travail aux molécules ayant des propriétés antioxydantes. Dans ce cadre, on a étudié les extraits d'une espèce végétale ; Centaurea microcarpa Coss et Dur., suivant deux approches

I.1. Les polyphenols :

Avec environ 9000 structures naturelles élucidées à ce jour, les polyphénols constituent une famille importante de métabolites secondaires de faible poids moléculaire du règne végétal (Akowah et al, 2004), qui correspondent à une très large gamme de structures chimiques et sont un bon témoin de l'extraordinaire capacité de biosynthèse des plantes. Ce sont des corps dont la molécule contient plusieurs fonctions phénols (Ferguson L, 2000), ces corps jouent un rôle fondamental car sont des éléments importants de qualités sensorielles (couleur et caractère organoleptique.) et nutritionnelles des végétaux que consomme l'homme et leur intervention dans la santé et maintenant reconnue dans des domaines variés,anticoncerigene ,antioxydant, la lutte contre le vieillissement des cellules (Sarni-Manchado et Cheynier,2006), anti oestrogenique et anti inflammatoire, certains d'eux sont dits non nutritionnels car ils ne jouent aucun rôle dans la plantes.

Une bonne reconnaissance de la localisation des composés phénoliques dans les différents tissus et organes végétaux est souvent essentielle pour orienter l'utilisation que l'homme souhaite en faire.

A l'échelle cellulaire, la localisation des composés est très caracteristique.Ils s'accumulent principalement dans deux sites : d'une part la paroi cellulaire ou sont présentes les lignines et la

vacuole RX \RQ \tRFké\ O\ SNénRl\ \RlXRe\ [lntNRF l11\, KlMRnRl\, Ilnin\, I FRtlin\

flavonoïdes (quercétine, kamphérol) pourraient également être présents au niveau du noyau et de la membrane plasmique mais toujours à très faible concentration.

A l'échelle tissulaire, on observe également des repartions très inégales des différents composés phénoliques. Ainsi les anthocyanes et les pigments de type flavonols sont généralement présent dans les couches cellulaires externes des organes végétaux en particulier les épidermes de fruits et des feuilles.(Sarni et Cheynier ,2006).

Plusieurs milliers de polyphénols ont été identifiés chez les plantes dont plusieurs centaines dans les plantes comestibles. Il est généralement admis que les humains ingèrent environ 1 gramme de polyphenols par jour (Akowah et al, 2004).

Tableau 01 : Classement des fruits et légumes les plus riches en polyphénols :
( Brad et al., 2008 )

	Fruits et légumes	PP totaux ( mg GAE/100 g )
01	$ EtiFKIIIXtJ(JF IXEJI	321.3
02	Persil	280.2
03	Fraise	263.8
04	Choux de Bruxelles	257.1
05	Litchi	222.3
06	Raisin	195.5
07	Abricot	179.8
08	Pomme	179.1
09	Echalote	104.1
10	Datte	99.3
11	Brocoli	98.9
12	Cerise	94.3
13	Figue	92.5
14	Célerie	84.7
15	Oignon	76.1
16	Nectarine blanche	72.7
17	Fruit de passion	71.8
18	Poire	69.2
19	Mangue	68.1
20	Aubergine	65.6

Les polyphénols sont particulièrement abondants dans les fruits. Leur teneur Peut atteindre 263.8. mg GAE / 100 g dans certains fruits comme les fraises, les pommes, les raisins.

Les légumes contiennent aussi des quantités importantes de PP. le champion toute catégories est l'artichaut avec une concentration de 321.3 mg GAE / 100 g.

Parmi les 20 premiers fruits et légumes les plus riches en polyphénols. 60 % représentent les fruits et le reste des 40 % est représenté par les légumes

L'extraction, la séparation, la caractérisation et le dosage des composées phénoliques se fait selon plusieurs méthodes, les plus utilisées et employées sont résumé dans le tableau qui suit :

	Techniques :		Principe:		Référence :
Extraction	Extraction par les solvants (macération)		Le contacte entre le solvant(liquide) et la matière végétale (solide) a pour but de libérer les polyphénols présents dans les cellules par rupture du tissus végétale et par diffusion.		Owen et johns, 1999 Hayouni et al.,2007
	Extraction par chromatographie sur colonne		Elle consiste à absorber sur une résine du type C18 pour les polyphénols et flavonoïdes des extraits végétaux puis à éluer sélectivement les substances polyphénoliques au moyen d'éthanol ou méthanol aqueux .
	Extraction supercritiques (SFE)		-Le CO2 supercritique, utilisé comme solvant d'extraction, du fait de sa faible viscosité lui confère une grande capacité de diffusion lui permettant d'avoir accès à des composées phénoliques liés a la paroi cellulaire et sa densité relativement élevé lui confère un pouvoir de solvatation ce qui permet un meilleur taux d'extraction. -Procédé non dénaturant. -Temps d'extraction réduit.		Chan et Maznah ,2009
Separation et purification	Chromatographie sur couche mince (CCM)		Séparation et purification des différents constituants en fonction de leur taille et de leur forme Les constituants du mélange se séparent par migration différentielle : chacun d'eux est d'autant plus entraîné par l'éluant qu'il est plus soluble dans celui-ci et moins adsorbé sur la phase stationnaire.		Tissut, 1967
	Chromatographie liquide haute performance (HPLC)		L'échantillon à analyser est poussé par un liquide (appelée phase mobile) dans une colonne remplie d'une		CastanedaOvando et al.,2009.
			phase stationnaire de fine granulométrie (les "grains" sont de très petite taille). Le débit d'écoulement de la phase mobile est élevé ce qui entraîne une augmentation de la pression dans le système. Ce débit élevé diminue le temps nécessaire pour séparer les composants le long de la phase stationnaire
	Chromatographie phase gaz (CPG)		Les différents solutés gazeux vont se séparer par migration différentielle le long de la phase stationnaire.		Colin-Henrion et al.,2008
Caracterisation		Chromatographie sur couche mince (CCM		Les constituants du mélange se séparent par migration différentielle : chacun d'eux est d'autant plus entraîné par l'éluant qu'il est plus soluble dans celui-ci et moins adsorbé sur la phase stationnaire.		Lawson,2006
		Spectrophotométrie UV-visible		méthode analytique quantitative qui consiste à mesurer l'absorbance ou la densité optique d'une substance chimique donnée en solution. Plus cette espèce est concentrée plus elle absorbe la lumière dans les limites de proportionnalités énoncées par la loi de Beer-Lambert. La densité optique des solutions est déterminée par un spectrophotomètre préalablement étalonné sur la longueur d'onde d'absorption de l'espèce chimique à étudier.		Harbourne et al.,2009
		HPLC-MS et RMN				Bassomo et al.,2004
Dosage		Dosage par spectrophotométrie		Par méthode de Folin ( non spécifique)		Harbourne et al.,2009
		Dosage par HPLC		Séparation sur colonne phase inverse C18 et détection à l'aide d'un spectrophotomètre UV 171		Lawson,2006

Les flavonoïdes présentent la plus grande classe de polyphénols, ils relèvent du métabolisme secondaire et sont très répondus dans le règne végétal. On estime que 2% de l'ensemble du carbone photo-synthétisé par les plantes est transformé en flavonoïdes (Alothmane et al.,2009).

Ils sont présent dans les feuilles, les fleurs, le pollen et les fruits, leur concentration augmente avec l'exposition au soleil et constituent de ce fait un écran protecteur contre la photo et la thermodégradation (protègent la plante des agressions du rayonnement UV) (Sarni-manchado et Cheynier, 2006). Ils participent aussi à la coloration des fleurs et des fruits et existent le plus souvent a l'état naturel sous forme d'hétérosides.

Les flavonoïdes sont des molécules polyphénoliques avec un squelette diphenylpropane (C6-C3- C6) (Alothmane et al., 2009), fait de 15 atomes de carbone, avec une grande diversité structurale, en effet, on en dénombre 5000 composés différents et présentant des propriétés de solubilités différentes influençant leurs extraction (Alothmane et al.,2009).

Plusieurs études ont soulignés que les flavonoïdes de différentes sources botaniques agissent comme antioxydants puissant encor plus que la vitamine C (Alothmane et al.,2009),

due principalement à la configuration catéchol du noyau B. Cette activité s'exerce surtout dans les milieux émulsionnés car ils sont peu solubles dans les phases lipidiques et protègent efficacement les lipoprotéines ou liposomes (Sarni-manchado et Cheynier, 2006). Les flavonoides agissent comme antioxydants primaires et stabilisent les radicaux peroxydes, mais peuvent aussi désactiver l'ion super-oxyde, le radical OH* ou l'oxygène singulet, inhiber la lipoxygénase ou encor chélater les métaux (surtout les flavonoïdes) (Sarni-manchado et Cheynier, 2006).

Deux cycles aromatiques de type phényl A et B liés par une chaine de trois carbone généralement cycliques.

Le degré d'oxydation du cycle détermine les différentes classes de flavonoïdes

Les composées phénoliques sont douées d'activités diverses, probablement su a leurs diversités structurales, le tableau suivant, englobe les activités biologiques des polyphénols les plus importantes :

Tableau 03 : Principales activités biologiques des composées phénoliques :

Classes de polyphénols	Activités	Références
Acide phénoliques	Anti carcinogènes Anti mutagènes Anti oxydants	Ferguson, 2001 Sarni-Manchado et Chenyier ,2006
Stilbénes	Inhibent l'oxydation des LDL et l'agrégation des plaquettes Anti carcinogènes Anti mutagènes	Sarni-Manchado et Chenyier, 2006 Ferguson, 2001
Coumarines	Anti carcinogènes Anti mutagènes Digestibilité des protéines	Ferguson,2001 Lazoui et al ,2006
Flavonoïdes	Anti carcinogènes Anti mutagènes Anti oxydants	Ferguson, 2001 Alothane et al ,2009
Anthocyanes	Anti oxydants Colorants	Sarni-Manchado et Chenyier ,2006 Ferguson, 2001
Lignines	Anti carcinogènes Anti mutagènes	Ferguson,2001
Tanins	Anti oxydants Anti tumoral Digestibilités des protéines	Mousavinejade et al. ,2009 Lazoui et al ,2006
Proanthocyanidines	Anti inflammatoires Anti bactériens Anti fongiques	Ferguson,2001

Recherche de substances bio actives de centaurea microcarpa coss et dur.

Introduction :

I.1. Les polyphenols :