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Diversité génétique des Rhizobia associés à† un champ de pois d'Angole (Cajanus cajan l.) à† Yamoussoukro (centre de la Côte d'Ivoire)

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par Kouakou Romain FOSSOU
Ecole supérieure d'agronomie de l'institut national polytechnique Félix HouphouŽt Boigny de Yamoussoukro - Diplôme d'agronomie approfondie  2011
  

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DEUXIEME PARTIE :

ETUDE EXPERIMENTALE

 
 

CHAPITRE VI : PRESENTATION DE L'ETUDE ET DES LABORATOIRES D'ACCUEIL

VI.1- OBJECTIFS DE L'ETUDE

Dans cette étude, on évalue la diversité génétique des rhizobia associés à des plants de pois d'Angole issus d'un champ cultivé à Yamoussoukro. Il s'agit à partir de nodosités prélevées :

- d'isoler les bactéries symbiotiques ;

- de les mettre en culture et les purifier ;

- de révéler la diversité génétique de ces bactéries à partir d'une PCR-RFLP ;

- et enfin, de constituer une collection de celles-ci et les conserver.

VI.2- PRESENTATION DU SITE DE COLLECTE DES ECHANTILLONS

Le matériel vivant utilisé (rhizobia) a été collecté à partir de jeunes plants de Cajanus cajan (4 à 14 mois) issus d'un champ cultivé à l'INP-HB. Ce champ, d'une superficie totale d'environ 1,5 ha, est la propriété du directeur des études du cycle des ingénieurs agronomes de l'Ecole Supérieure d'Agronomie (ESA). Il l'a mis en place en vue de produire des grains de pois cajan pour l'alimentation de sa volaille. Le champ est localisé à droite du chemin menant à l'ESA via le garage de l'INP Centre, précisément à 100 m dudit garage.

VI.3- PRESENTATION DES LABORATOIRES D'ACCUEIL DE L'ETUDE

Le principal laboratoire d'accueil de l'étude est celui d'Agronomie et Productions Végétales de l'Institut National Polytechnique Félix Houphouët Boigny (INP-HB) de Yamoussoukro (Annexe 2). Ce laboratoire a servi à l'isolement, la culture et la purification des souches rhizobiennes. L'analyse moléculaire de ces isolats a eu lieu au Laboratoire Central de Biotechnologie (LCB) du Centre National de Recherche Agronomique (CNRA) d'Abidjan-Adiopodoumé, précisément au sein de l'unité de virologie et de biologie moléculaire (Annexe 2).

CHAPITRE VII : MATERIEL ET METHODES

 

VII.1- MATERIEL

VII.1.1 - Matériel vivant

Le matériel vivant utilisé est constitué de 169 souches de rhizobia isolées d'environ 200 nodosités collectées. Les figures 9 a et 9 b suivantes présentent respectivement quelques nodosités sur racines et des nodosités préparées en vue de l'isolement des bactéries.

Figure 9 a: Nodosités sur racines de C. cajan Figure 9 b: Nodosités étalées pour l'isolement

VII.1.2 - Matériel technique

Le matériel technique utilisé dans cette étude est constitué de plusieurs équipements de laboratoire et des kits de réactifs. En effet, pour l'isolement, la culture et la purification des bactéries au Laboratoire de Productions Végétales de l'INPHB, un kit de réactif pour milieu TY (Tryptone Yeast Extract), des tubes Eppendorf et plus d'une centaine de boîtes de pétri ont été utilisés. Au LCB du CNRA d'Adiopodoumé, la constitution de la collection locale de rhizobia a nécessité 2 plaques à 96 puits chacune et du glycérol. La PCR a été possible grâce à un kit PCR contenant des amorces spécifiques à l'ADNr 16S des rhizobia, une enzyme de polymérisation (la Taq DNA polymérase) et divers appareils de laboratoire. Le thermocycleur est le plus important de tous ces appareils (figure 10 a). Celui-ci est muni d'un bloc thermique de 96 puits (figure 10 b) où l'on peut insérer les tubes contenant le mélange réactionnel de la PCR. Il est aussi équipé d'un couvercle qui pressant sur les capuchons des tubes, permet d'éviter l'évaporation du mélange réactionnel. Un clavier composé de quelques touches et un écran à cristaux liquides permettent d'entrer des programmes PCR dans la mémoire de la machine. Dans notre cas, nous avons utilisé un thermocycleur de type BIOMETRA UNO II.

(a) : Vue générale (b) : Bloc thermique

Figure 10 : Présentation d'un thermocycleur (Photos AVO, 2010)

Les autres appareils de laboratoire sont constitués d'une centrifugeuse utilisée pour séparer la phase aqueuse (le surnageant) du culot des bactéries cultivées sur milieu TY liquide. Il y a également un bain-marie servant à faire le choc thermique des bactéries afin d'avoir accès à quelques fragments d'ADN pour l'amplification. On cite aussi une machine à glace nécessaire pour la conservation des réactifs lors de la préparation de la solution réactionnelle, une micro-onde idéale pour la préparation de gel d'agarose et un appareil Mupid-One (figure 11) pour les migrations électrophorétiques. Un transilluminateur à caméra relié à un ordinateur (figure 12) muni du logiciel AlphaDigiDoc a permis de visualiser les fragments d'ADN après un temps de migration.

Figure 11: Appareil de migration Figure 12 : Transilluminateur relié à un ordinateur

(Photo AVO, 2010) (Photo AVO, 2010)

Les fragments amplifiés ont été digérés dans le bain-marie grâce à une enzyme de restriction, la Tsp 509I -R0576S. Pour la migration et la visualisation des résultats de cette digestion, les mêmes appareils ayant permis d'observer les résultats de la PCR ont été utilisés.

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