DEUXIEME PARTIE :
ETUDE EXPERIMENTALE
CHAPITRE VI : PRESENTATION DE L'ETUDE ET DES
LABORATOIRES D'ACCUEIL
VI.1- OBJECTIFS DE L'ETUDE
Dans cette étude, on évalue la diversité
génétique des rhizobia associés à des plants
de pois d'Angole issus d'un champ cultivé à Yamoussoukro.
Il s'agit à partir de nodosités
prélevées :
- d'isoler les bactéries symbiotiques ;
- de les mettre en culture et les purifier ;
- de révéler la diversité
génétique de ces bactéries à partir d'une PCR-RFLP
;
- et enfin, de constituer une collection de celles-ci et les
conserver.
VI.2- PRESENTATION DU SITE DE COLLECTE DES
ECHANTILLONS
Le matériel vivant utilisé (rhizobia) a
été collecté à partir de jeunes plants de
Cajanus cajan (4 à 14 mois) issus d'un champ cultivé
à l'INP-HB. Ce champ, d'une superficie totale d'environ 1,5 ha, est la
propriété du directeur des études du cycle des
ingénieurs agronomes de l'Ecole Supérieure d'Agronomie (ESA). Il
l'a mis en place en vue de produire des grains de pois cajan pour
l'alimentation de sa volaille. Le champ est localisé à droite du
chemin menant à l'ESA via le garage de l'INP Centre,
précisément à 100 m dudit garage.
VI.3- PRESENTATION DES LABORATOIRES D'ACCUEIL DE
L'ETUDE
Le principal laboratoire d'accueil de l'étude est
celui d'Agronomie et Productions Végétales de l'Institut National
Polytechnique Félix Houphouët Boigny (INP-HB) de Yamoussoukro
(Annexe 2). Ce laboratoire a servi à l'isolement, la
culture et la purification des souches rhizobiennes. L'analyse
moléculaire de ces isolats a eu lieu au Laboratoire Central de
Biotechnologie (LCB) du Centre National de Recherche
Agronomique (CNRA) d'Abidjan-Adiopodoumé, précisément au
sein de l'unité de virologie et de biologie moléculaire
(Annexe 2).
CHAPITRE VII : MATERIEL ET METHODES
VII.1- MATERIEL
VII.1.1 - Matériel vivant
Le matériel vivant utilisé est constitué
de 169 souches de rhizobia isolées d'environ 200 nodosités
collectées. Les figures 9 a et
9 b suivantes présentent respectivement quelques
nodosités sur racines et des nodosités préparées en
vue de l'isolement des bactéries.
 
Figure
9 a: Nodosités sur racines de
C. cajan Figure
9 b: Nodosités
étalées pour l'isolement
VII.1.2 - Matériel technique
Le matériel technique utilisé dans cette
étude est constitué de plusieurs équipements de
laboratoire et des kits de réactifs. En effet, pour l'isolement, la
culture et la purification des bactéries au Laboratoire de Productions
Végétales de l'INPHB, un kit de réactif pour milieu TY
(Tryptone Yeast Extract), des tubes Eppendorf et plus d'une centaine
de boîtes de pétri ont été utilisés. Au LCB
du CNRA d'Adiopodoumé, la constitution de la collection locale de
rhizobia a nécessité 2 plaques à 96 puits chacune et du
glycérol. La PCR a été possible grâce à un
kit PCR contenant des amorces spécifiques à l'ADNr 16S des
rhizobia, une enzyme de polymérisation (la Taq DNA polymérase) et
divers appareils de laboratoire. Le thermocycleur est le plus important de tous
ces appareils (figure 10 a). Celui-ci est muni d'un bloc
thermique de 96 puits (figure 10 b) où l'on peut
insérer les tubes contenant le mélange réactionnel de la
PCR. Il est aussi équipé d'un couvercle qui pressant sur les
capuchons des tubes, permet d'éviter l'évaporation du
mélange réactionnel. Un clavier composé de quelques
touches et un écran à cristaux liquides permettent d'entrer des
programmes PCR dans la mémoire de la machine. Dans notre cas, nous avons
utilisé un thermocycleur de type BIOMETRA UNO II.
 
(a) : Vue
générale (b) : Bloc
thermique
Figure 10 :
Présentation d'un thermocycleur (Photos AVO, 2010)
Les autres appareils de laboratoire sont constitués
d'une centrifugeuse utilisée pour séparer la phase aqueuse (le
surnageant) du culot des bactéries cultivées sur milieu TY
liquide. Il y a également un bain-marie servant à faire le choc
thermique des bactéries afin d'avoir accès à quelques
fragments d'ADN pour l'amplification. On cite aussi une machine à glace
nécessaire pour la conservation des réactifs lors de la
préparation de la solution réactionnelle, une micro-onde
idéale pour la préparation de gel d'agarose et un appareil
Mupid-One (figure 11) pour les migrations
électrophorétiques. Un transilluminateur à caméra
relié à un ordinateur (figure 12) muni du
logiciel AlphaDigiDoc a permis de visualiser les fragments d'ADN après
un temps de migration.
 
Figure 11: Appareil de migration
Figure 12 : Transilluminateur relié à un
ordinateur
(Photo AVO, 2010)
(Photo AVO, 2010)
Les fragments amplifiés ont
été digérés dans le bain-marie grâce à
une enzyme de restriction, la Tsp 509I -R0576S. Pour la migration et
la visualisation des résultats de cette digestion, les mêmes
appareils ayant permis d'observer les résultats de la PCR ont
été utilisés.
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