VII.2- METHODES
Les méthodes évoquées
ici sont celles de la récolte des nodules, de l'isolement, la culture et
la purification des bactéries, de l'amplification du gène cible
ADNr 16S ainsi que de sa digestion pour évaluer la diversité
génétique des bactéries. La méthode de constitution
de la collection locale des bactéries est également
exposée.
VII.2.1 - Récolte des nodules et isolement des
souches bactériennes
Les nodules ont été récoltés au
champ à l'aide d'une tarière. Des tubes Ependorf de 15
ml, remplis d'eau à moitié, ont servi à maintenir
hydratés les nodules afin d'assurer la survie des bactéries. Au
laboratoire, leur isolement a suivi le protocole suivant:
- les nodules ont été lavés avec de l'eau
distillée pour enlever toute trace de terre ;
- chaque nodule lavé superficiellement avec l'eau
distillée a été désinfecté par trempage dans
de l'eau de javel pendant une trentaine de secondes ;
- après ce bref temps, l'eau de javel a
été immédiatement éliminée par une
série de rinçages des nodules avec de l'eau distillée
stérile ;
- les nodules ont été ensuite
étalés un à un, sur des gouttes d'eau dans des
boîtes de pétri ;
- emmenés sous une hotte, ils ont été
écrasés au moyen de cônes préalablement
stérilisés à 120°C pendant 2 heures;
- l'isolement des bactéries a été
réalisé par prélèvement d'une quantité du
broyât de chaque nodule à l'aide d'un cure-dent
stérilisé, puis son ensemencement sur du milieu TY solide
(BERINGER, 1974) (Annexe 3) coulé dans des boîtes
de pétri et divisé en quartiers;
- les milieux ensemencés puis identifiés ont
été ensuite incubés à l'étuve à
30°C ;
- Après 24 heures ou 48 heures passées à
l'étuve, chaque culture bactérienne a été
retirée et conservée au réfrigérateur.
Par la suite, les bactéries ont
été cultivées continuellement sur des boîtes de
pétri, à intervalles de temps variables, en vue de les purifier.
Après trois cycles de purification à l'INP-HB, les souches ont
été cultivées sur milieu TY solide, coulé en
inclinaison dans des tubes Eppendorf stériles de 15 ml. Cette
dernière culture a servi pour les manipulations au Laboratoire Centrale
de Biotechnologie (LCB) du CNRA à Adiopodoumé.
Au LCB, les souches issues de cette dernière
culture ont été cultivées une fois sur milieu TY liquide
pour l'étude de la diversité, à raison de 3 ml du milieu
par souche. Une réplique de cette dernière culture a
été également réalisée pour une longue
conservation de toutes les souches à -80°C. Les deux plaques de 96
puits chacune ont été utilisées à cet effet et
chaque puits a eu comme contenu, 100 ul de suspension bactérienne +
quelques gouttes de glycérol.
Cette réplique constitue l'ébauche de la
collection locale des rhizobia symbiotes du C. cajan.
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