WOW !! MUCH LOVE ! SO WORLD PEACE !
Fond bitcoin pour l'amélioration du site: 1memzGeKS7CB3ECNkzSn2qHwxU6NZoJ8o
  Dogecoin (tips/pourboires): DCLoo9Dd4qECqpMLurdgGnaoqbftj16Nvp


Home | Publier un mémoire | Une page au hasard

 > 

Diversité génétique des Rhizobia associés à† un champ de pois d'Angole (Cajanus cajan l.) à† Yamoussoukro (centre de la Côte d'Ivoire)

( Télécharger le fichier original )
par Kouakou Romain FOSSOU
Ecole supérieure d'agronomie de l'institut national polytechnique Félix HouphouŽt Boigny de Yamoussoukro - Diplôme d'agronomie approfondie  2011
  

précédent sommaire suivant

Bitcoin is a swarm of cyber hornets serving the goddess of wisdom, feeding on the fire of truth, exponentially growing ever smarter, faster, and stronger behind a wall of encrypted energy

VII.2- METHODES

Les méthodes évoquées ici sont celles de la récolte des nodules, de l'isolement, la culture et la purification des bactéries, de l'amplification du gène cible ADNr 16S ainsi que de sa digestion pour évaluer la diversité génétique des bactéries. La méthode de constitution de la collection locale des bactéries est également exposée.

VII.2.1 - Récolte des nodules et isolement des souches bactériennes

Les nodules ont été récoltés au champ à l'aide d'une tarière. Des tubes Ependorf de 15 ml, remplis d'eau à moitié, ont servi à maintenir hydratés les nodules afin d'assurer la survie des bactéries. Au laboratoire, leur isolement a suivi le protocole suivant:

- les nodules ont été lavés avec de l'eau distillée pour enlever toute trace de terre ;

- chaque nodule lavé superficiellement avec l'eau distillée a été désinfecté par trempage dans de l'eau de javel pendant une trentaine de secondes ;

- après ce bref temps, l'eau de javel a été immédiatement éliminée par une série de rinçages des nodules avec de l'eau distillée stérile ;

- les nodules ont été ensuite étalés un à un, sur des gouttes d'eau dans des boîtes de pétri ;

- emmenés sous une hotte, ils ont été écrasés au moyen de cônes préalablement stérilisés à 120°C pendant 2 heures;

- l'isolement des bactéries a été réalisé par prélèvement d'une quantité du broyât de chaque nodule à l'aide d'un cure-dent stérilisé, puis son ensemencement sur du milieu TY solide (BERINGER, 1974) (Annexe 3) coulé dans des boîtes de pétri et divisé en quartiers;

- les milieux ensemencés puis identifiés ont été ensuite incubés à l'étuve à 30°C ;

- Après 24 heures ou 48 heures passées à l'étuve, chaque culture bactérienne a été retirée et conservée au réfrigérateur.

Par la suite, les bactéries ont été cultivées continuellement sur des boîtes de pétri, à intervalles de temps variables, en vue de les purifier. Après trois cycles de purification à l'INP-HB, les souches ont été cultivées sur milieu TY solide, coulé en inclinaison dans des tubes Eppendorf stériles de 15 ml. Cette dernière culture a servi pour les manipulations au Laboratoire Centrale de Biotechnologie (LCB) du CNRA à Adiopodoumé.

Au LCB, les souches issues de cette dernière culture ont été cultivées une fois sur milieu TY liquide pour l'étude de la diversité, à raison de 3 ml du milieu par souche. Une réplique de cette dernière culture a été également réalisée pour une longue conservation de toutes les souches à -80°C. Les deux plaques de 96 puits chacune ont été utilisées à cet effet et chaque puits a eu comme contenu, 100 ul de suspension bactérienne + quelques gouttes de glycérol.

Cette réplique constitue l'ébauche de la collection locale des rhizobia symbiotes du C. cajan.

précédent sommaire suivant






La Quadrature du Net