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Diversité génétique des Rhizobia associés à† un champ de pois d'Angole (Cajanus cajan l.) à† Yamoussoukro (centre de la Côte d'Ivoire)

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par Kouakou Romain FOSSOU
Ecole supérieure d'agronomie de l'institut national polytechnique Félix HouphouŽt Boigny de Yamoussoukro - Diplôme d'agronomie approfondie  2011
  

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VII.2.2 - Préparation des cellules bactériennes par effet thermique

La PCR permettant d'amplifier à partir de petits fragments le gène ciblé sur le génome, on a effectué un choc thermique sur les bactéries afin d'avoir accès à quelques fragments d'ADNr 16S. Pour chaque bactérie, ce choc thermique a eu lieu sur 1 ml de sa suspension de 3 ml préalablement cultivée pendant 2 jours dans un incubateur-agitateur à 30°C. Les différentes étapes de ce choc thermique sont les suivantes :

- passage sur glace de chaque prélèvement bactérien (1 ml) contenu dans un tube de 1,5 ml ;

- centrifugation à 12000 t/min pendant 10 min de toutes les souches prélevées;

- recueil du culot bactérien pour chaque souche centrifugé;

- reprise du culot dans 100 ul d'eau distillée stérile et homogénéisation au vortex;

- passage sur glace des différentes souches ;

- chauffage des souches au bain-marie à 100°C pendant 10 min ;

- enfin, retour sur glace jusqu'à refroidissement total des souches.

Chaque bactérie ainsi préparée est prête pour la réalisation de la PCR-RFLP sur l'ADNr 16S.

VII.2.3 - Amplification et digestion de la région 16S de l'ADNr des rhizobia par PCR-RFLP

VII.2.3.1 - Principe de la PCR-RFLP et choix du gène de l'ADNr 16S

VII.2.3.1.1 - Principe de la PCR-RFLP

L'approche PCR-RFLP conduit à comparer la longueur des fragments de restriction d'une région choisie du génome et préalablement amplifiée par PCR, afin de déterminer le polymorphisme. Cette région est utilisée comme substrat pour les enzymes de restriction. Les enzymes de restriction sont des endonucléases qui reconnaissent spécifiquement une séquence courte (4 à 8 bases) et coupent la chaîne d'ADN chaque fois qu'elles reconnaissent cette séquence élémentaire. L'ADN se retrouve ainsi fragmenté en morceaux de différentes longueurs séparés en fonction de leur taille par électrophorèse sur un support physique. Un fragment va migrer d'autant plus loin qu'il est court. Un polymorphisme de la longueur des fragments de restriction est ainsi mis en évidence. Les profils observés permettent l'analyse de la diversité des souches par :

- la caractérisation de chaque isolat ;

- l'estimation des divergences de séquences entre isolats et l'établissement de leur proximité phylogénétique (NDOYE, 1998).

VII.2.3.1.2 - Choix du gène de l'ADNr 16S

Les gènes ribosomiques sont utilisés comme marqueurs moléculaires dans l'étude phylogénétique de différents organismes en raison de leur universalité, leur abondance, leur taille convenable aux analyses comparatives (LUDWIG et SCHLEIFER, 1999). Les ADNr contiennent par ailleurs des régions de séquences hautement conservées, très utiles pour la désignation des amorces (HILLIS et DIXON, 1991 ; STAHL et AMMAN, 1991) et d'autres régions de séquences suffisamment variables pour servir comme un excellent moyen taxonomique (GRIMONT et GRIMONT, 1986).

Chez les procaryotes particulièrement, les gènes codant pour les ARN ribosomaux sont organisés en opérons qui contiennent également des espaces intra-géniques ainsi que d'autres gènes codant pour les ARN de transfert (ARNt) (figure 13).

Figure 13 : Organisation de l'opéron de l'ADNr observé chez les procaryotes (D'après EL HILALI, 2006)

Comme le montre la figure 13, il existe trois types d'ADN ribosomique : le 5S, le 16S et le 23S (JENSEN et STRAUS, 1993). L'ADNr 5S est très peu utilisé dans les études de diversité vu sa petite taille d'environ 120 nucléotides. Contrairement à ce dernier, l'ADNr 16S codant pour la petite sous unité ribosomique d'environ 1500 pb (opéron rrs : ribosomal RNA small subunit) et l'ADNr 23S codant pour la grande sous unité d'environ 2500 à 3000 pb (opéron rrl : ribosomal RNA large subunit) (GÜRTLER et STANISICH, 1996) sont très utilisés. L'espace entre ces deux opérons est transcriptionnel d'où la désignation ITS (Internal Transcribed Spacer) (NORMAND et al., 1996). Il est aussi utilisé dans ces études. Toutefois, depuis que WOESE (1987) a montré que le gène de l'ADNr 16S est présent chez toutes les bactéries, qu'il a la même fonction et que sa structure est conservée, plusieurs chercheurs l'ont préférentiellement utilisé comme une approche rapide pour évaluer la variabilité génétique entre les souches de rhizobia (LAGUERRE et al., 1994 ; NOUR et al., 1994b).

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