La Peste des Petits Ruminants au Niger: enquête sérologique dans les régions de Niamey, Tahoua et Tillabéry

4.4. Analyse des prélèvements au laboratoire

Deux types de tests ont été utilisés pour analyser les prélèvements ayant servi à réaliser ce travail :

- L'ELISA de compétition ;

- La PCR.

4.4.1. ELISA

a) Introduction

ELISA est l'acronyme d'un examen de laboratoire appelé en anglais EnzymeLinked ImmunoSorbent Assay ou dosage d'immunosorption liée à une enzyme, c'est-à-dire un dosage immunoenzymatique sur support solide.

Ce test entre dans le cadre plus général des EIA (Enzyme Immuno Assay), dans lequel le dosage est couplé à une réaction catalysée par une enzyme libérant un composant coloré suivi par spectroscopie. L'ELISA est une technique biochimique, principalement utilisée en immunologie, afin de détecter la présence d'un anticorps (Ac) ou d'un antigène (Ag) dans un échantillon. La technique utilise un ou deux Ac dont l'un est spécifique de l'Ag, et l'autre, réagissant aux complexes immuns (Ag-Ac), est couplé à une enzyme. Cet Ac secondaire, responsable du nom de la technique, peut aussi causer l'émission d'un signal par un substrat chromogène ou fluorogène.

L'ELISA pouvant être utilisée tant pour évaluer la présence d'un Ag que celle d'un Ac dans un échantillon, est un outil efficace pour déterminer aussi bien des concentrations sériques d'Ac (test HIV par exemple) que pour détecter la présence d'un Ag. Il a aussi trouvé des applications dans l'industrie alimentaire. L'ELISA est devenue un outil important pour le diagnostic et les programmes

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d'épidémiosurveillance de plusieurs maladies importantes des animaux domestiques.

La division IAEA/FAO a développé des « Kits » ELISA qui sont utilisés à large échelle pour le diagnostic de la Peste Bovine, de la Peste des Petits Ruminants, de la Péripneumonie Contagieuse Bovine, de la Fièvre aphteuse, de la Brucellose, de la Babésiose, de la Leucose enzymatique et de la Trypa nosomose.

Les avantages de l'ELISA sont multiples : c'est un test simple, rapide, très sensible, peu coûteux, facile à automatiser et qui permet d'analyser plusieurs sérums à la fois. Mais la technique a aussi ses inconvénients et ses limites (GEERTS, 2006).

b) Principes

On distingue deux types d'ELISA : le type compétitif appelé aussi « Blocking » ELISA, et le type non compétitif.

Pour l'analyse de nos échantillons, nous avons eu recours au « blocking » ELISA.

Dans un test ELISA de type compétitif, on évalue dans quelle mesure les Ac qui sont présents dans l'échantillon sont capables d'inhiber la réaction d'AC couplée à une enzyme avec l'Ag (fixé sur le support solide). La quantité d'Ac présente dans l'échantillon à tester, qui a réagi avec l'Ag, est inversement proportionnelle à l'intensité de la couleur qui se développe lors de la réaction.

Prélèvement positif Prélèvement négatif

-

+

Ag

-

Ag

I- Immobilisation de l'antigène sur Support solide (microplaque en Polystyrène)

Présence d'Ac spécifique Absence d'Ac spécifique

Compétition

Prélèv Ac Lab Ac

Ag

E

Prélèv.
Ac

Ag

S

conj

Prélèv.
Ac

Ag

Pas de compétition

Lab Ac

Ag

Prélèv
Ac

II- Addition du prélèv. et de l'Ac de laboratoire

standardisé, hautement Spécifique à l'Ag considéré

S P

Conj
Lab Ac
Ag

Conj Lab Ac Ag

E

E

Incubation-lavage

III- Addition d'Ig anti-espèce (anti-Lab) Conjuguée à une enzyme ( EX : HRPO)

Incubation-lavage

IV- Addition du chromogène et du substrat de l'enzyme

Lecture de l'absorbance

Figure 10 : ELISA compétitive indirecte pour la détection d'anticorps (source : IAEA, 1994)

Ac : anticorps, Ag : antigène, Conj : conjugué, E : enzyme, HRPO : Horse Radish Peroxydase, Ig : immunoglobuline, Lab : laboratoire, Prélèv : prélèvement, P : peroxydase, S : substrat

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c) Echantillon à tester

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A côté du sérum ou du plasma, on peut aussi tester des échantillons de lait, d'urine, de salive ou même de selles. L'avantage d'échantillons de lait ou de salive est qu'ils sont plus faciles à prélever qu'un échantillon de sang. L'inconvénient par contre est que souvent, le taux d'immunoglobulines y est plus faible. Dans les selles, on peut rechercher des copro-Ag ou des copro-Ac. Il est très important que la prise et la conservation des échantillons de sérums soient faites de manière adéquate, parce que cela peut influencer les résultats de l'ELISA par la suite. La prise des échantillons de sang doit être faite de façon aseptique afin d'éviter toute contamination bactérienne.

La congélation - décongélation répétée des sérums a un effet néfaste sur la qualité des résultats surtout dans l'ELISA pour la détection des Ac. Pour éviter les problèmes de ce genre, il vaut mieux préparer de petites quantités (« aliquots ») et de les conserver dans des tubes bien fermés au congélateur (GEERTS, 2006).

d) Matériel : Il est composé : - d'un incubateur à 37° ;

- d'un lecteur ELISA ;

- d'un bain marie ;

- des pipettes multicanaux ajustables variables de 5-50 ul, 50-250 ul ; - des pipettes simples ajusta bles de 5-50 ul, 50-200ul, 100-200 ul ;

- des cônes ajustables de qualité ;

- des microplaques Nunc Maxishorp, normalement à fond plat en polystyrène à 96 cupules ;

- des flacons avec couvercles pour contenir les différentes dilutions des réactifs.

e) Réactifs et différentes phases de l'ELISA de compétition

> L'antigène :

*la fiabilité (sensibilité et spécificité) du test ELISA de compétition dépend largement de la qualité de l'Ag.

La spécificité et la répétitivité des résultats seront plus élevées en utilisant des Ag purifiés (au lieu d'extraits bruts), mais souvent la sensibilité diminue.

L'utilisation d'Ag recombinants permet une meilleure standardisation. *la sensibilisation (« coating ») des microplaques avec l'Ag (ou des immunoglobulines) se fait généralement dans un tampon alcalin
(carbonate pH neutre ou même pH acide pour des Ag de type polysaccaride sont aussi utilisés).

> Le blocage (« blocking »)

*But : éviter la fixation non spécifique des réactifs sur la phase immuno - adsorbante au cours de la réalisation de l'ELISA. Le blocage doit minimiser les fausses réactions positives.

*La fixation non spécifique est empêchée de façon curative ou préventive :

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- Curative par le lavage adéquat des plaques après chaque étape de l'ELISA en utilisant un tampon de lavage contenant du tween 20 (acide laurique, détergent).

- Préventive en bloquant les sites libres (non couverts par l'Ag spécifique) sur la phase solide avec des protéines non relévantes (sérum - albumine bovine, caséine, lait écrémé). Elle se fait dans une étape séparée après la sensibilisation des plaques.

NB : on peut aussi ajouter ces protéines non relévantes en excès dans les liquides de dilution du sérum et ou du conjugué.

> Le conjugué

Le conjugué est le résultat du couplage entre une enzyme et un Ac dirigé contre une immunoglobuline spécifique d'une certaine espèce animale. Dans le commerce, un large spectre de conjugué est disponible. Les abréviations suivantes sont souvent utilisées :

- RAB (IgG/HRP =rabbit anti bovine IgG (Ac produit contre IgG de bovins par immunisation de lapin) couplé à la « horse radish peroxydase » (HRP) ;

- GAH (IgM/AP = goat anti horse IgM couplé à la phosphatase alcaline

(AP).

Les enzymes les plus utilisées sont la peroxydase et la phosphatase alcaline.

La dilution optimale du conjugué c'est-à-dire celle qui produit la plus petite réaction non spécifique (couleur de fond) avec les échantillons négatifs et qui distingue bien les échantillons positifs, doit être identifiée pour chaque lot.

> Le substrat/chromogène

Sous l'influence de l'enzyme, certains substrats ont la propriété de donner des produits de réactions solubles colorés, qui permettent des dosages précis de densité optique. La réaction enzyme - substrat a une intensité proportionnelle à la quantité d'enzyme présente dans le milieu et donc indirectement avec la quantité d'Ag ou d'Ac qu'on veut mesurer. Le substrat est différent selon l'enzyme utilisée.

La peroxydase réagit avec le chromogène en présence d'eau oxygénée (H₂O₂). Une couleur différente est obtenue en fonction du produit utilisé :

-Ortho - phénylène diamine (OPD) ? couleur jaune

-Tétraméthylbenzidine (TMB) ? couleur bleue

-Azimo diéthyl Benzo Thiazoline Sulfonic acid (ABTS) ? couleur verte

NB : H₂O₂ est un produit qui n'est pas très stable. Il faut le protéger contre la lumière et le conserver dans un réfrigérateur dans un flacon en verre non transparent. Il faut renouveler régulièrement la solution (au risque de voir la densité optique chuter). La réaction enzymatique se fait à température ambiante, ou mieux à température fixe et dans l'obscurité. Elle peut être arrêtée en ajoutant une solution acide ou alcaline (changement de pH).

Comme les lecteurs automatiques d'ELISA sont capables de lire une plaque entière très vite, l'arrêt de la réaction enzymatique n'est pas strictement nécessaire.

f) Lavage

Chaque étape de l'ELISA est suivie d'un lavage afin d'éliminer l'excès de réactifs ; le lavage est très important pour éviter les réactions non spécifiques.

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Pour éviter des problèmes, le lavage doit être standardisé au maximum. Le plus souvent on utilise un tampon de lavage (PBS) contenant du tween 20 comme tensio - actif. Le lavage peut se faire manuellement ou en utilisant des appareils semi - automatiques. Si ces derniers sont bien entretenus, ils peuvent diminuer la variabilité des résultats. Souvent, les meilleurs résultats (bonne réceptivité et reproductibilité) sont obtenus en faisant le lavage manuel et en prenant soin que les dernières traces du tampon de lavage soient enlevées en renversant la plaque et en tapant vigoureusement contre une serviette.

NB : qualité de l'eau

Dans certains pays, la qualité de l'eau n'est souvent pas optimale ; ce qui peut causer des problèmes dans la réalisation de l'ELISA. L'eau utilisée pour la dilution du conjugué est très importante parce que des impuretés peuvent inhiber ou diminuer son activité enzymatique. De préférence, on utilise l'eau distillée pour la préparation des tampons ou du liquide de lavage en ELISA.

g) Lecture et expression des résultats

Les densités optiques (DO) ont été lues au spectrophotomètre Multiskan EX à 492 nm de longueur d'onde.

Les valeurs des pourcentages d'inhibition (PI) pour les échantillons des sérums ont été calculées selon la formule suivante :

OD des sérums échantillons

PI = 100 - × 100

OD du contrôle du monoclonal

Le PI moyen d'un sérum a été calculé sur deux puits. Les échantillons avec un

PI > à 50 p. 100 ont été considérés positifs selon les indications du test.

h) Protocole

- Phase de sensibilisation :

L'antigène a été dilué au 1/100. Pour une plaque : 6000 ul de PBS + 60 ul d'antigène ont été préparés. La répartition a été de 50 ul par puits. La plaque a été incubée pendant 1 heure à 37°C sous agitation ou 1 nuit au réfrigérateur (+ 4°C) ;

- Solution de lavage : du PBS a été dilué au 1/5 dans de l'eau distillée ou de l'eau désionisée. La plaque a été lavée 3 fois ;

- Tampon de saturation :

Une solution contenant du PBS + 0,05% de tween 20 + 0,5% de sérum négatif (v/v) a été préparée.

Ainsi, pour 6000 ul × 3 (étapes) soit 18000 ul de PBS par plaque, il a

fallu :

18000 × 0,05 = 9 ul de tween 20

100

18000 × 0,5 = 90 ul de sérum négatif

100

- Phase de compétition : ont été successivement reparties les

composantes suivantes :

*tampon de saturation : 45u l dans toutes les cupules

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+ 5 ul en F₁, F₂, G₁, G₂ (Cm)

+ 55 ul en A₁ et A₂ (Cc)

* sérums à tester : 5u l dans les cupules

* strong positif (C++) : 5u l dans les cupules B₁, B₂, C₁, C₂

* weak positif (C+) : 5u l dans les cupules D₁, D₂, E₁, E₂

* sérum négatif (C-) : 5u l dans les cupules H₁ et H₂

* monoclonal : 50u l dans toutes les cupules sauf A₁ et A₂

La plaque a été incubée 1 heure à 37°C sous légère agitation puis lavée 3 fois en prenant le soin d'éviter le dessèchement des plaques dans le cas où il y en a plusieurs ;

- Phase du conjugué :

Le conjugué a été dilué au 1/1000 (v/v) ; soit 600 ul de TS + 6 ul de conjugué

La répartition a été de 50 ul par cupule dans toute la plaque qui a été ensuite incubée pendant 1 heure à 37°C sous légère agitation. La plaque a été lavée 3 fois en évitant le dessèchement ;

- Phase du substrat chromogène :

Ont été dissous 1 comprimé d'OPD dans 75 ml d'eau distillée ou désionisée et 1 comprimé de H₂O₂ dans 10 ml d'eau distillée ou désionisée. Pour reconstituer la solution du substrat/chromogène, ont été utilisés 4 ul de H₂O₂ pour 1 ml de solution d'OPD ce qui représente donc pour 1 plaque : 6 ml d'OPD + 24 ul de H₂O₂.

La répartition a été de 50 ul par cupule dans toute la plaque (ainsi que les 8 cupules du blancking) ; la plaque a été laissée 10 mn à l'obscurité.

- Phase d'arrêt :

Ont été repartis 50 ul d'acide sulfurique à 5,5%

Acide : H₂SO₄ à 5,5% = 55 ml H₂SO₄ + 945 ml H₂O distillé ou désionisée - Lecture avec un filtre à 492 nm.