4.4.2. La PCR
a) Définition
La réaction en chaîne par polymérase (PCR
est l'abréviation anglophone de Polymerase Chain Reaction, acronyme
français ACP pour Amplification en Chaîne par
Polymérisation) est une méthode de biologie moléculaire
permettant d'amplifier plusieurs milliards de fois le nombre de copies d'une
séquence spécifique d'ADN (amplicon), même si la
quantité initiale est très faible (quelques Picogrammes).
b) Principe
La PCR est une technique basée sur une
répétition de cycles de transition de température. Sauf
pour certaines méthodologies, chaque cycle comprend trois étapes
:
La condition native se fait en général à
température ambiante. L'ADN bicaténaire adopte sa conformation en
double hélice.
La dénaturation initiale : avant de commencer les
cycles de PCR proprement dits, une étape de chauffage
(généralement 10 à 15 mn à 95°C) est
réalisée. Cette étape permet de déshybrider les ADN
double brins, de casser les structures secondaires,
d'homogénéiser le milieu réactionnel par agitation
thermique, d'activer les polymérases de type « Hot start », de
dénaturer d'autres enzymes qui pourraient être dans la
solution.
·
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La phase de dénaturation : cette étape
(généralement de 0 à 1 mn à 95°C) permet de
déshyb rider les ADN, de « décrocher » les
polymérases qui seraient encore liées à une matrice et
d'homogénéiser le milieu réactionnel ;
· La phase d'hybridation ou d'appariement des amorces :
cette étape (généralement de 2 à 60 secondes
à 56 - 64°C) permet aux amorces sens et anti sens de s'hybrider aux
ADN matrice grâce à une température qui leur est
thermodynamiquement favorable. Peu de brins d'ADN matrice peuvent s'hybrider
(se lier) avec leur brin complémentaire, ce qui empêcherait la
fixation des amorces, car ces dernières sont bien plus courtes et en
concentration bien plus importante ;
· La phase d'élongation ou d'extension : cette
étape (généralement de 4 à 120 secondes à
72°C) permet aux polymérases de synthétiser le brin
complémentaire de leur ADN matrice à une température qui
leur est optimale. Ce brin est fabriqué à partir des dNTP libres
présents dans le milieu réactionnel. La durée de cette
étape dépend normalement de la longueur de l'amplicon.
c) Protocole
Etant donné que le virus de la PPR est à ARN,
il était nécessaire d'utiliser un protocole permettant de
convertir l'ARN en ADN avant la réalisation de la PCR. Aussi, pour
l'analyse de nos échantillons, avons-nous eu recours à la RT-PCR
one steep (en une étape). C'est un protocole mélangeant les
réactifs de la RT (Reverse Transcriptase qui est une enzyme transcrivant
l'ARN en ADN afin d'utiliser ce dernier en PCR) et de la PCR afin que les deux
étapes puissent se faire sans avoir à ouvrir le tube. Cela permet
de réduire le risque de
contamination ou d'inversion d'échantillons, mais il est
plus difficile
d'optimiser le milieu réactionnel pour chaque
étape.
d) Réalisation de la PCR > Les réactifs
utilisés
· Les primers :
Ce sont deux (2) oligonucléotides dénommés
NP3 et NP4 qui ont été utilisés comme amorces. Ils
amplifient 300 paires de bases :
NP3 (24 bases) : 5' - TCT CGG AAA TCG CCT CAC AGA CTG -3'
NP4 (24 bases): 5' - CCT CCT CCT GGT CCT CCA GAA TCT -3'
Ces amorces se présentent sous forme
lyophilisée à reconstituer avec 1 ml de tampon Tris EDTA (TAE) ou
dans l'eau distillée stérile selon les recommandations du
fabriquant. Ils sont à la concentration de 52,9 mol/ul pour NP3 et 21,9
mol/ul pour NP4 ; la concentration de travail étant de 15 pmol/ul et 2
ul ont été utilisés par réaction.
· Les dNTP
Le réactif utilisé est une solution
prémixée prête à l'emploi. Le
prémélange ou le stock solution est à une concentration de
10 mM de chaque dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP). La concentration de travail est
de 25 mM et 2 ul ont été utilisés par réaction. La
conservation a été faite à - 20°C.
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· Le kit de l'ADN polymérase
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- L'enzyme : il s'agit de la Taq polymérase extraite
à partir de Thermus aquatus, une bactérie thermophile très
résistante à des températures très
élevées. La solution stock est de 5 U/ul. La dilution a
été faite au 1/5 et 2 ul ont été utilisés
par réaction.
- Le tampon de réaction 5X (RT-PCR buffer) : il est
utilisé directement dans la réaction PCR à la dilution au
1/10 ; un volume de 10 ul a été utilisé par
réaction.
-H2O bi/distillée
· Le kit d'extraction de l'ARN
- tampon de lyse RLT,
- solutions de lavage RW1 et RPE, - eau traitée au
DEPC
> L'extraction de l'ARN avec le kit Qiagen
1) Dans un tube Eppendorf, ont été ajoutés
:
· 100 ìl de prélèvement à
tester,
· 350 ìl de tampon de lyse RLT
(mélangés pour une bonne homogénéisation),
· 3,5 ìl de â mercaptoethanol
2) Le lysat a été centrifugé dans une
microcentrifigeuse de paillasse pendant 3 mn pour récupérer le
surnagent homogénéisé ;
3) 350 ìl d'éthanol 70% ont été
ajoutés au lysat homogénéisé et
mélangés à l'aide d'une micropipette ;
4) Le mélange de l'étape 3) a été
mis sur une colonne « RNeasy Spin Column », adaptée à
un tube de 1,5ml et centrifugé 15 secondes à 10 000 tours/min
;
5) Le liquide écoulé a été
rejeté, et le même tube a été
réutilisé à l'étape N° 6 ;
6) Ont été ajoutés sur la colonne «
RNeasy Spin Column » 700 ìl du tampon de lavage RW1. Après
la centrifugation, le liquide écoulé a été
rejeté comme ci- dessus ;
7) La colonne « RNeasy Spin Column » a
été placée dans un nouveau tube de 1,5 ml. Ont
été mis 500 ìl de tampon de lavage RPE (voir NB) sur la
colonne. Une centrifugation comme la précédente a
été effectuée et le liquide écoulé a
été rejeté, mais le tube a été
réutilisé dans l'étape N° 8 ;
NB : Le tampon de lavage RPE est fourni sous forme
concentrée. Il faut ajouter 4 volumes d'éthanol 100% avant
d'obtenir la solution de travail du tampon de lavage RPE.
8) Ont été ajoutés 500 ìl de
tampon de lavage RPE (solution de travail) sur la colonne et la centrifugation
a été faite pendant 2 min à grande vitesse 10 000
tours/min pour éliminer toutes les traces d'éthanol ;
9) La colonne a été transférée dans
un nouveau tube de 1,5 ml pour faire l'élution du RNA avec de l'eau
traitée au DEPC 1% ;
50 ìl d'eau traitée au DEPC 1% ont
été ajoutés sur la colonne et la centrifugation a
été faite pendant 60 secondes à 10 000 tours/mn.
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La suspension de RNA ainsi obtenue a été
conservée à -70°C ou -80°C ou immédiatement
utilisée dans la synthèse du cDNA.
> Réaction de Reverse Transcription (RT)
7 ul du mix 1 (tableau III) et 5 ul d'ARN ont
été répartis par puits dans la plaquette ou barrette qui a
été ensuite placée dans le thermocycleur suivant ce
programme : 65°C pendant 5 minutes.
Tableau III : volume des réactifs du mix 1
5 ul
1 ul
1 ul
H20
dNTP
Mix 1
Volume pour 1 échantillon
Radom primer
8 ul par puits de mix 2 (tableau IV) sont ajoutés dans la
plaquette ou barrette qui a été placée dans le
thermocycleur selon le programme ci-dessous :
Programme : 37°C pendant 50 minutes 70°C pendant 15
minutes
Tableau IV : volumes des réactifs du mix 2
DTT
Mix 2
Volume pour 1 échantillon
Tampon 5X
4 ul
2 ul
RNase out
MMLV
1 ul
1 ul
> Réaction de PCR one step
50 ul de mix (tableau V) ont été répartis
par puits dans la plaque ou barrette. Ont été prévus les
contrôles suivants :
-contrôle positif : cDNA ou produit de la PCR
-contrôle négatif : H2O
bi/distillée
La plaque ou barrette a été placée dans le
thermocycleur et l'amplification de l'ADN a été lancée
selon le programme suivant :
1) 95°C pendant 10 min
2) 94°C pendant 45 s
3) 55°C pendant 30 s
4) 72°C pendant 30 s
Le cycle a été repris 29 fois de l'étape 2)
à l'étape 4)
5) 72°C pendant 5 min
6)
4°C pendant 1 min
Mix
Volume pour 1 échantillon
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Tableau V : volumes des réactifs du mix de la
PCR
Echantillon (après la RT)
Tampon 5X (RT-PCR buffer)
dNTP
Mix primers (NP3, NP4)
Taq polymérase
H20 DEPC
Total
10 ul
10 ul
2 ul
2 ul
2 ul
24 ul
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e) Analyse de l'amplifiât
> Electrophorèse en gel d'aga rose
Sa réalisation débute en général
avant la fin de l'amplification.
· Les tampons et réactifs
- Poudre d'Aga rose ;
- Tampon d'électrophorèse TAE 10X : le TAE 1X est
obtenu en diluant 10 fois la solution stock ;
- Gel loading buffer (GLB) ou marqueur
d'électrophorèse ou bleu de charge : ce composé sert
à la fois à faire descendre l'ADN amplifié au fond du
puits du gel et à suivre l'évolution de la migration grâce
à sa couleur ;
- Bromure d'éthidium : solution stock de 10mg/ml
utilisé à la concentration de travail de 0,5 ug/ml de gel
préparé ;
- Marqueur de poids moléculaire : solution stock de
concentration de 1 ug/ul dilué au 1/10 pour avoir la solution de
travail. Sa taille est de 100 paires de bases.
· Protocole
1) 2 g d'agarose ont été mélangés
à 150 ml de TAE 1X. La dissolution a été faite dans un
four à micro-onde ;
2) Après refroidissement (environ 40° C), la
solution a été mélangée avec 10 ul de bromure
d'éthidium ;
3) Dans le moule apprêté, un peigne de 12 dents
a été posé à 0,5 cm de l'un des bords puis le gel a
été coulé lentement au centre en prenant soin
d'éviter la formation des bulles qui, si elles se formaient,
étaient éliminées à l'aide d'une pointe de
micropipette pour ne pas gêner la migration ;
4) Après solidification, le peigne a été
retiré délicatement et le moule a été placé
dans la cuve à électrophorèse contenant du TAE 1X en
prenant soin de s'assurer que les puits sont du côté de la borne
négative, car la migration se déroule vers la borne positive ;
5) La quantité suffisante de TAE 1X a
été ajoutée pour couvrir le gel ;
6) Dans le premier puits du gel, ont été
introduits 5 ul de marqueur de poids moléculaire ;
7)
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Dans les autres puits du gel, ont été
déposés un mélange contenant 5 ul de bleu de charge et 15
ul de produits PCR préalablement préparés sur
du papier parafilm (le deuxième puits contenant le
témoin positif et le troisième puits le témoin
négatif) ;
8) Après couverture du bac de migration, le
générateur a été réglé à 60 V.
La migration se poursuivait jusqu'à ce que le marqueur
d'électrophorèse atteigne la taille des produits PCR attendus.
> Visualisation sous rayonnement ultraviolet
A la fin de la migration, le DNA a été
visualisé directement sur une table d'ultraviolet. Le gel a
été ensuite photographié.
4.5. Analyses statistiques
La prévalence sérologique des anticorps anti-PPR
a été évaluée en rapportant le nombre de
sérums positifs au nombre total de sérums. Les résultats
obtenus ont été analysés avec le logiciel STATISTICA 6.1.
Ces résultats sont exprimés en pourcentage (%) et les
différences sont considérées significatives au seuil de
probabilité P < 0,05.
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