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Validation de procédé de production d'antigène viral sur culture cellulaire bhk21

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par Ghaith Ben Messaoud
Institut Supérieur des Technologies Médicales de Tunis - Licence Appliquée en Biotechnolgies Médicales 2013
  

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VIII.2.4. Agglutination sur latex

Les billes de latex, gélatine ainsi que les Globules Rouges (GR) peuvent jouer le rôle de particules révélatrices de la présence des Ac qui vont agglutiner les Ag recouvrant leur surface. Le recours à l'agglutination dépend de la disponibilité de l'Ag purifié (Chapel et al., 2004).

Les tests d'agglutination au latex sont particulièrement utiles pour les Laboratoires de soins de santé primaires, car ils sont simples et les résultats sont faciles à interpréter. Depuis 1982, plusieurs études comparatives des tests commerciaux d'agglutination au latex pour la détection des Ac de la rubéole ont été signalées ( León et al, 1988).

La sensibilité et la spécificité du test d'agglutination au latex étaient de 100% et 94% (Weissfeld et al., 1982).

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VIII.2.5. Hémolyse Radiale (HR)

Dans le test HR pour les Ac spécifiques du virus de la rubéole, les sérums obtenus peu après la primo-infection produisent une perturbation appelée «hémolyse ménagée». L'hémolyse ménagée est provoquée par un Ac IgG contre le virus de la rubéole et représente un nouveau principe de sérodiagnostic. Cette technique, à coté du dosage des IgM, permet le diagnostic rapide de la rubéole récente, sur un échantillon unique de sérum (Hedman et al., 1986).

VIII.2.6. Test de neutralisation

La neutralisation du virus est définie comme la perte de pouvoir infectieux due à la réaction d'un virus avec un Ac spécifique.

La neutralisation peut être utilisée pour identifier le virus isolé ou comme dans le cas du diagnostic de rubéole de mesurer la réponse immunitaire au virus.

Comme un test fonctionnel, la neutralisation s'est avérée très sensible, technique spécifique et fiable, mais elle ne peut être réalisée que dans des Laboratoires de virologie qui comprennent seulement une petite fraction des Laboratoires effectuant la sérologie de la rubéole (Mendelson et al., 2006).

VIII.2.7. Technique de fixation du complément

Le principe de la technique de fixation du complément repose sur le principe que le complément est fixé puis activé par le complexe (Ac-Ag). Après la décomplémentation du sérum à tester (pour éliminer toute source non contrôlée du complément), ce dernier est mis en présence de l'Ag viral à étudier avec une quantité définie de complément de cobaye. La réaction est révélée par l'ajout d'un second couple (Ac-Ag) constitué de GR revêtus d'Ac anti-GR. Si le sérum ne contient pas l'Ac spécifique du virus à étudier le complément pout se fixer sur le second couple et entraine la lyse des GR, mais si le complément est consommé par le premier couple et les GR restent intacts. Ainsi l'hémolyse signifie l'absence d'Ac (Mammette, 2002).

Les Ag spécifiques de la rubéole utilisés pour la fixation du complément ont été synthétisés dans des cultures tissulaires de cellules Rabbit Kidney (RK13) et des cultures primaires de rein de singe vert africain.

Les Ac qui fixent le complément apparaissent chez des patients atteints de rubéole peu de temps après la fin de l'éruption et persistent pendant au moins 8 mois (Sever, et al., 1965).

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VIII.2.8. Test d'Inhibition d'hémagglutination (IHA)

Jusqu'à maintenant, l'évaluation de l'immunité contre la rubéole et son diagnostic ont été effectués principalement par le test IHA qui est basé sur la capacité du virus de la rubéole, à agglutiner les GR. Le test IHA est un travail intensif, et est actuellement réalisé principalement par des Laboratoires de références. IHA est le «gold standard» de test sur lequel la quasi-totalité de dépistage de la rubéole et d'autres tests de diagnostic sont mesurés. Pendant le test, l'agglutination est inhibée par la liaison d'Ac spécifiques à l'agglutinine virale. Les titres sont exprimés comme la plus haute dilution inhibant l'hémagglutination dans des conditions d'essais normalisées (Mendelson et al., 2006).

VIII.2.9. Hémagglutination virale

Les GR humains, ou ceux d'autres animaux peuvent agglutiner le virus à différentes quantités. Le virus peut être identifié par l'hémagglutination qui est une méthode quantitative, rapide et peu couteuse. Ce test mesure le nombre total de particules virales présentes et peut servir à mesurer la quantité d'Ac spécifiques (Jawetz et al., 1973).

? Le développement des tests d'hémagglutination et IHA pour le virus de la rubéole a fourni des outils précieux pour la détection des Ac dirigés contre ce virus. Ces tests sont plus rapides et plus faciles à réaliser que le test de neutralisation pour la détection des Ac par fluorescence, elles fournissent des informations plus fiables sur la sensibilité que ceux du test de fixation du complément (Auletta, et al., 1968).

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I. Préparation du local et matériel

Pour réussir le procédé de culture de l'hémagglutinine rubéolique il faut d'abord réussir le

procédé de stérilisation et désinfection du Laboratoire (local et matériel):

? Désinfection du Laboratoire

? Stérilisation du matériel (Les équipements doivent être nettoyés et entretenus

régulièrement)

? Contrôle de stérilité

I.1. Préparation du local

C'est l'étape primordiale et la plus essentielle.

La stérilisation avec l'alcool 95% ou l'éthanol à 70% est utilisé pour nettoyer et désinfecter les paillasses et les équipements du Laboratoire (Microscope inversé, Hotte, Bain marie, Appareil Roller, Étuve).

I.1.1. Stérilisation de l'atmosphère

Le formol a été mis dans l'eau chaude (10 ml de formol ont été mises dans 500ml d'eau bouillie) pour stériliser le Laboratoire. La vapeur de formol dégagée va assurer une stérilisation presque totale de tout le Laboratoire et même des équipements (Hotte, Appareil Roller, Bain marie, Étuve) qui sont en fonctionnement ou à porte ouvertes.

Un contrôle de stérilité sur boites de pétris contenant la Gélose nutritive est nécessaire pour s'assurer de la stérilisation des surfaces et de l'atmosphère.

I.2. Préparation du matériel

Les flacons, verreries, tubes et bouteilles Roller utilisés lors de la culture cellulaire doivent être lavés et stérilisés.

Tout le matériel utilisé a été lavé par un détergent ou désinfectant, séché dans un four à 60°C avant d'être stérilisé.

I.2.1. Stérilisation du matériel

La stérilisation du matériel est obligatoire. Elle peut se faire de deux manières: ? Stérilisation par la chaleur sèche

? Stérilisation par la chaleur humide

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La stérilisation par la chaleur sèche se fait grâce au four Pasteur. Les verreries, bouteilles Roller, tubes et flacons en verre pyrex sont mises 1h à 200°C au four.

La méthode de stérilisation par la chaleur humide est assurée par l'autoclave.

Tout le matériel (verrerie, tubes, flacons et bouteilles d'eau distillée...) est mis dans l'autoclave pour une stérilisation à 120°C pendant 30 min (le cycle dure 2h tenant compte du temps de chauffage et de refroidissement de l'autoclave).

Le matériel utilisé, les solutions de contrôle de stérilité (Thioglycolate et Bouillon Trypto-caséine de soja) et Tryptose phosphate passent par un seul cycle d'autoclavage avec des températures différentes suivant la notice des Milieux de culture.

I.3. Contrôle de stérilité du local

Après la désinfection, la Gélose nutritive a été répartie dans des boites de pétris. Les boites contenant le Gel sont placées semi ouvertes sur les paillasses et les équipements de culture (Étuve, Appareil Roller, Hotte) pendant 30 min puis incubées dans l'Étuve à 37°C pendant 14 jours avec lecture tous les 24 h pour s'assurer de la stérilité du matériel et du local.

 

Figure 11: Contrôle de stérilité

II. Matériel utilisé pour la production et la Validation de l'hémagglutinine (HA) rubéolique

II.1. Appareillage et matériel technique de la culture cellulaire et test ELISA indirect de type IgG

· Hotte à flux laminaire (TelstarBio II 8)

· Étuve à CO2 JOUAN(IGI50)

 

· Bain marie(JOUAN)
· Microscope (CK Olympus
TOXKYO)

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· Appareil Roller (WHERTON 753680)

· Centrifugeuse (sigma 3K30)

 

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· Spectrophotomètre lecteur de plaque ELISA (ELISA MULTISKAN EX)

· Étuve d'incubation à 37°C (Memmert)

 

· Plaque de microtitration
· Plaque ELISA

· Micropipette multicanaux

II.2. Réactifs chimiques et Tampons pour la production et Validation de l'HA rubéolique

· Polyéthylène glycol: PEG6000
· Chlorure de sodium 1M: NaCl

· Tampon Glycine (1M, pH=10)
· Di-éthyle Ether

· Solution Tween 80
· Tampon GGB

· Tampon Tacetal (Tampon Acide +Tampon Alcalin)

· Tampon de lavage PBS-Tween (Phosphate Buffered saline-Tween)

· Tampon Carbonate/Bicarbonate (0,1M, pH=9,6)

· Tampon de saturation PBS-Tween-Gélatine 5%

· Conjugué anti IgG humain
· Substrat chromogène OPD (Orto-
Phénylène Diamine)

· Solution d'arrêt (acide sulfurique H2SO4 4N)

III. Milieu pour la culture cellulaire

III.1. Milieu DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)

Figure 12: Milieu DMEM

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Le Milieu DMEM (LONZA lab. LOT N 2MB103 CAT BE12-604f) est un Milieu de culture cellulaire nécessaire au maintien et à la prolifération des cellules BHK21.

Il s'agit d'un Milieu avec L.Glutamine et 4,5g de glucose. Il contient plusieurs composantes comme les Vitamines, les acides aminés et des sels inorganiques.

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Nous avons ajouté au Milieu DMEM plusieurs autres éléments comme l'Antibiotique (pénicilline et streptomycine), le Sérum de veau foetal et la Tryptose phosphate, ce qui va favoriser la croissance cellulaire. Le Milieu DMEM est utilisé à différentes concentrations: 0%, 2%, 5% et 10% Sérum de veau foetal (SVF) (annexe 1) selon les étapes de la culture cellulaire ou au cours de l'inoculation du virus. Lors de la culture cellulaire le Milieu DMEM est conservé à +4°C (Le Milieu doit être conservé au froid et l'abri de la lumière).

III.2. Additifs pour Milieu DMEM

? Sérum de veau foetal (SVF)

La présence de Sérum est indispensable pour la croissance des cellules.

Figure 13: SVF

Le Sérum de veau foetal (SVF) (GIBCO BRL Cat No 10106-060 lab .LOT N40G8843F) possède divers facteurs de croissance qui permettent la prolifération cellulaire, des hormones, des protéines, des facteurs d'attachement, comme la fibronectine, qui contribuent à une bonne adhésion, indispensable à la division cellulaire, et assure un rôle protecteur.

Le SVF est d'abord décomplémenté à 55°C pendant 30 min pour éliminer son action toxique sans détruire les protéines. Le SVF doit être conservé à -20°C et à +4°C après de son utilisation.

? Solution d'Antibiotique (ATB)

Figure 14: Antibiotiques

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Les Antibiotiques (ATB) (annexe 1) utilisés sont la pénicilline G et la streptomycine. La pénicilline G (Pharmachim Bulgaria Lot NO 702321.1H) est utilisée contre les contaminations bactériennes surtout par les bactéries Gram positives alors que la streptomycine (Pharmadrug Production GmbH, Lot NO 4140) agit sur certains bacilles Gram négatifs et certaines cocci Gram positives.

Ces deux ATB sont fournis sous forme de poudre. Ils sont préparés sous forme de mélange dans 100ml d'eau distillée.

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Cette solution d'ATB est utilisée pour réduire le risque de contamination dans la culture cellulaire.

Les solutions d'ATB sont conservées à +4°C.

? Tryptose phosphate

La Tryptose phoshate (DIFCO lab LOT 128487) (annexe 1) est un additif (Vitamine) ajouté au Milieu de culture DMEM. Le pH du Tryptose phosphate est égal à 7,3.

Nous avons mélangé la Tryptose phosphate avec l'eau distillée (29,5g/L) puis stérilisé à l'autoclave.

 

Figure 15: Tryptose phosphate

III.2.1. La Trypsine

La Trypsine (GIBCO BRL lab.lot N3055949 Cat N25300-054, flacon de 100ml) est une enzyme utilisée en culture cellulaire pour détacher des cellules adhérentes sur les flasques de culture.

Figure 16: Trypsine

Le traitement par la Trypsine affecte un peu la viabilité des cellules. C'est pourquoi l'action de la Trypsine doit être limitée et inhibée par l'ajout du SVF.

Cette solution est conservée à -20°C et à +4°C après son utilisation. La Trypsine est activée à 37°C.

III.2.2. Préparation du Milieu de culture par la méthode de stérilisation à froid

La stérilisation du Milieu de culture est un procédé important. Cette étape nous permet d'éviter la contamination du Milieu. (Elle se fait sous Hotte).

Le Milieu DMEM doit subir une stérilisation à froid. La pression exercée par la bouteille d'azote pousse le Milieu DMEM à travers 2 membranes filtrantes de 0,45 et 0,22 um. Ces deux membranes empêchent le passage des microorganismes.

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Après la filtration, le Milieu DMEM doit être reparti dans des flacons et conservé à +4°C.

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III.3. Contrôle de stérilité du Milieu de culture et des additifs

Le Milieu de culture DMEM (0%, 2%, 5% et 10% SVF) et les autres additifs doivent subir un test de stérilité avant d'être utilisé en culture cellulaire.

1 ml de chaque lot (Milieu DMEM et additifs) est ajouté dans 5ml des Milieux de contrôle de stérilité (Thioglycolate, Bouillon Trypto-caséine soja et Gélose Sabouraud) avec un Témoin de chaque solution. La lecture des tubes pour la vérification de la contamination se fait pendant 14 jours à 37°C dans l'Étuve.

Figure 17: Contrôle de stérilité du Milieu de culture et additifs

? Bouillon Trypto-caséine soja

Le Bouillon Trypto-caséine soja (BIOKAR Lot/Batch 9M577) (annexe 2) permet de détecter et révéler une contamination par des germes aérobies.

La lecture pour le contrôle de stérilité se fait quotidiennement pendant 14 jours.

? Thioglycolate

Le Thioglycolate (Scharlau Ref.03-187) (annexe 2) est utilisé pour le contrôle et la détection d'une éventuelle contamination par les bactéries anaérobies.

La lecture pour le contrôle de stérilité se fait aussi quotidiennement pendant 14jours.

? Gélose Sabouraud

La Gélose Sabouraud a été préparée est fournie par le Laboratoire général de L'institut Pasteur de Tunis. C'est un Milieu solide utilisé pour détecter une éventuelle contamination par les champignons (levures et moisissures).

L'incubation de la Gélose Sabouraud se fait entre 20 à 25 °C. La lecture du test de stérilité se fait chaque jour pendant 14 jours.

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IV. Production de l'HA rubéolique

IV.1. Matériel biologique

? Lignée cellulaire BHK21

La lignée cellulaire BHK21 va servir de support pour la culture en masse et la prolifération du virus de la rubéole afin de produire l'HA. Dans ce projet l'ampoule qui contient les cellules BHK21 passage 123 du 20/4/1996 est congelée dans l'azote liquide.

Les cellules sont maintenues en vie dans l'ampoule qui contient un Milieu de conservation constitué par SVF et le DMSO noté aussi diméthylsulfoxyde.

Figure 18: Observation

Microscopique des cellules BHK21

? Souche virale (virus de la rubéole M33)

Le virus de la rubéole M33 a été préparé a partir de la cellule souche VERO (lignée cellulaire dérivant de rein de singe). La cellule VERO donne un ECP en un temps court. La multiplication virale dans la culture cellulaire peut être mesurée par une quantification de l'ECP.

La souche M33 (suspension virale préparée a partir de la cellule VERO) a été fournie du Service de Virologie Clinique de L'Institut Pasteur de Tunis. Cette souche est utilisée lors de ce projet pour la production et la Validation de l'HA rubéolique grâce à la lignée cellulaire BHK21.

IV.2. Procédé de production de l'HA rubéolique par la technique de culture cellulaire

Les étapes de la culture cellulaire pour la production de l'HA du virus de la rubéole sont décrites comme suit:

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