IV.2.1. Décongélation des cellules BHK21
Il faut pratiquer une bonne technique pour obtenir une
proportion élevée de cellules survivantes à cette
procédure.
ISTMT-IPT 2012-2013
28
L'ampoule qui contient les cellules BHK21 a été
retirée de la bouteille d'azote liquide, puis décongelée
au Bain marie à 37°C pendant quelques secondes.
Après la décongélation le contenu de
l'ampoule a été transféré dans une flasque de
culture de 25 cm2 avec ajout de 10 ml du Milieu DMEM 10% SVF pour
éliminer l'action du DMSO et pour le réveille cellulaire.
? Cette étape se fait sous la Hotte.
La flasque qui contient les cellules BHK21 est mise dans
l'Étuve à 37°C sous 5% de CO2 pour l'incubation.
L'incubation se fait pendant 4 à 5h à 37°C pour que les
cellules adhérent au fond du flasque. Après l'état des
cellules et leur adhésion au fond du flasque est vérifiée
à l'aide d'un Microscope inversé. Un changement de Milieu DMEM 5%
SVF est effectué. La flasque est ensuite remise à l'Étuve
à 37°C.
Figure 19: Décongélation des
cellules BHK21
IV.2.2. Les différents passages lors de la culture
des cellules BHK21
Après 48h d'incubation à 37°C une
deuxième vérification de l'état des cellules est
effectuée par le Microscope inversé.
L'ancien Milieu DMEM 5% SVF, contenu dans la flasque 25
cm2 est déjà épuisé. Un virage de sa
couleur vers le jaune signifie que le Milieu est devenu défavorable pour
les cellules et leur multiplication. Un premier passage de la flasque
25cm2 vers une flasque 75cm2 contenant le Milieu DMEM 5%
SVF est alors effectué.
? Le passage cellulaire se fait grâce à la
solution de Trypsine (étape de trypsination).
? D'abord il faut éliminer l'ancien Milieu DMEM 5% SVF
de la flasque 25cm2. Un rinçage des cellules par la solution
de Trypsine est effectué pour décoller les cellules de support.
Une incubation quelques secondes dans l'Étuve est nécessaire pour
que la Trypsine effectue son rôle de dissociation.
ISTMT-IPT 2012-2013
? Lorsque les cellules sont bien dispersées un ajout
d'une quantité du Milieu DMEM 5% SVF (10ml) est effectué pour
inhiber l'action de la Trypsine. La pipette a un rôle important
grâce à son mouvement d'aspiration et de refoulement avec une
forte vitesse pour la dissociation des cellules. Le contenue de la flasque
25cm2 est transféré dans une autre flasque plus grande
(75cm2) et une quantité suffisante du Milieu DMEM 5% SVF est
ajoutée pour le bon déroulement de la culture.
Après 48h d'incubation un deuxième passage
cellulaire de la flasque 75cm2 vers la flasque 150cm2 est
nécessaire après une vérification de l'état des
cellules.
|
Figure 20: Observation Microscopique des
cellules BHK21 dans la flasque 150cm2
|
Figure 21: Incubation dans l'Étuve
à 37°C
|
Chaque passage nécessite un temps d'incubation de 48h.
De cette manière tous les passages seront effectués dans les
diverses flasques 25, 75,150 et 225cm2 puis dans les bouteilles
Roller.
29
(Les étapes d'élimination du Milieu DMEM 5% SVF,
de la trypsination, de la dissociation des cellules et d'ajout du nouveau
Milieu de culture dans les flasques puis dans les bouteilles Roller sont les
mêmes dans tous les passages).
ISTMT-IPT 2012-2013
30
Figure 22: Passage des cellules BHK21
V. Inoculation du virus M33
L'inoculation virale en culture cellulaire a pour but la
multiplication du virus et la production d'HA.
Le tube contenant la suspension virale M33 est
décongelé et le Milieu DMEM 5% SVF est éliminé des
bouteilles Roller. L'étape qui suit est l'inoculation. Dans chaque
bouteille Roller 1 ml de suspension virale est mise, soit environ 1 virus pour
2 cellules (Nous avons compté 200 millions de cellules par bouteille
Roller. 1 ml de suspension virale a un titre de 108 virus). 30 ml du
Milieu DMEM 2% SVF sont ajoutés dans la bouteille Roller.
Figure 23: Inoculation du virus
Après une heure d'incubation à
température ambiante les bouteilles sont mises dans l'Appareil Roller
à 37°C avec une rotation continue pour une durée de 7h.
Enfin, un rinçage avec le Milieu DMEM 0% SVF est effectué et un
nouveau Milieu DMEM 0% est ajouté et l'incubation se poursuit pour une
durée de 3 jours à 37°C dans le Milieu DMEM 0% SVF.
Le procédé de passage cellulaire et inoculation du
virus est résumé comme suit:
1 flasque 25 cm 2 1 flasques 75 cm2 2
flasques 150cm2
4 flasques 225cm2 4 bouteilles Roller Inoculation
virale
V.1. ISTMT-IPT 2012-2013
31
ISTMT-IPT 2012-2013
32
Récolte
Après 3 jours d'incubation vient l'étape de la
récolte. Le surnageant de chaque bouteille Roller est
récupéré dans un flacon de 500ml. Puis nous avons
ajouté à ce surnageant le Chlorure de sodium
(NaCl) 2,2g% et le Polyéthylène glycol
(PEG 6000) 6g%. Une homogénéisation par agitation est
effectuée. Le précipité est mis sous agitation à
+4°C.
V.2. Extraction de l'HA rubéolique
Après 48h sous agitation à +4°C nous avons
procédé à une centrifugation à 4°C à
3000 tours/min pendant une heure. Par la suite le surnageant est
éliminé et le culot est resuspendu dans le Tampon Glycine
de pH 10 (annexe 3) (soit environ 1 ml/bouteille Roller), ensuite la
solution Tween 80 à 1,25% est ajouté au culot
(annexe 3) (soit 1 volume de Tween 80 est ajouté a 9
volume d'HA). Ce mélange est incubé à 4°C pour une
durée de 3 à 5 min.
La solution de Di-éthyle Ether (5 volume
de Di-éthyle Ether) est ajoutée sous agitation
à +4°C pendant 15 min. Le mélange, est par la suite
centrifugé à +4°C pendant 15 min à 3000 tours/min. La
phase aqueuse ainsi obtenue, est récupérée et
conservée à -20°C.
C'est le lot d'HA rubéolique (1/2013).
Figure 24: Lot d'hémagglutinine
V.3. Titrage de l'HA rubéolique par la technique
d'hémagglutination
Après la production de l'HA rubéolique vient
l'étape du titrage.
Le titrage de l'HA se fait par la technique
d'hémagglutination.
L'hémagglutination est la capacité de l'Ag viral
à agglutiner les GR.
Pour effectuer le test d'hémagglutination il faut:
? GR de pigeon; fournis par le Service de
Microbiologie Vétérinaire de L'Institut
Pasteur de Tunis.
· Tampon Tacetal (annexe 4)
préparé et utilisé pour effectuer les différentes
dilutions.
· Tampon GGB (annexe 4)
préparé et utilisé pour le lavage des GR du pigeon.
· Ag rubéolique (Lot de l'HA
rubéolique 1/2013).
| 
