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Détermination "in vitro " du pouvoir antibactérien des huiles essentielles d'eucalyptus, myrte, clous de girofle et sarriette, et leur application à  la conservation de la viande fraàŪche type hachée.

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par Souhila Boubrit et Nafaa Boussad
Université Mouloud Mammeri de Tizi-ouzou - Ingéniorat d'état en biologie, option contrôle de la qualité et analyses 2007
  

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3- Tests d'activité antimicrobienne des H.E.

3.1- Critères de sélection des souches

Le choix des souches est basé sur plusieurs paramètres:

- Les souches sont d'origine hospitalière, responsables de Toxi-infections Alimentaires (TIA) (S. aureus, S. paratyphi A.);

- pour leurs fréquences élevées à contaminer les denrées alimentaires et particulièrement la viande et produits carnés;

- les souches sont choisies pour leur résistance naturelle à divers types d'agents antimicrobiens. (S. aureus est souvent retenu comme bactérie-test dans les normes d'évaluation de l'activité des antiseptiques et désinfectants (AFSSA, 2003).

3.2- Souches bactériennes

Six souches bactériennes ont été utilisées dans notre travail. Des bactéries Gram-positif (G+): S. aureus et B. cereus, et des bactéries Gram-négatif (G-): S. paratyphi A., S. flexneri, E. coli et P. aeruginosa. Cinq (05) de ces souches bactériennes ont été isolées cliniquement à l'Hôpital Universitaire de Tizi Ouzou tandis que la souche P. aeruginosa a été isolée directement à partir de la viande et produit carnés au niveau du Laboratoire Vétérinaire Régional de Draa Ben Khedda (Tizi Ouzou).

Les souches qui ont été testées, nous ont été en partie, aimablement fournies par Dr HOUALI Karim, Maître de conférences (Département de Biochimie Microbiologie, Faculté des Sciences Biologiques et des Sciences Agronomiques, Université Mouloud Mammeri Tizi Ouzou). Les souches ont été reçues dans des tubes à gélose inclinée, conservés à une T° de réfrigération (2#177;1 °C). La souche de P. aeruginosa nous a été également, aimablement fournie par Melle MALKI Ouiza du Laboratoire Vétérinaire Régional de Drâa Ben Khedda (Tizi Ouzou).

3.3- Confirmation des souches

Pour chacune des souches un pré-enrichissement a été effectué sur le milieu d'isolement sélectif (cf. figure 20) puis une coloration de Gram a été réalisée selon le modèle suivant :

- Préparer un frotti ;

- recouvrir le frotti avec de violet de Gentiane ; laisser agir 1mn ; rincer à l'eau distillée ;

- verser du Lugol et le laisser agir pendant 1 mn ;

- décolorer à l'alcool à 95°, entre 15 et 30 secondes ; rincer à l'eau distillée ;

- fixation avec de la fuchsine pendant 10 à 30 secondes ; rincer à l'eau distillée ; - sécher au-dessus de la flamme d'un bec Bunsen ;

- observation au microscope optique à l'objectif x 100 à immersion, les Gram+ se colorent en violet tandis que les Gram- apparaissent colorés en rose.

Tableau IV : Coloration de Gram et morphologie des souches bactériennes utilisées.

Souches

Milieu de culture

Gram

Morphologie microscopique

S. aureus

Gélose Chapman

+

Coccobacilles en grappes de
raisin

B. cereus

Gélose lactosée
au bromocrésol
pourpre (BCP)

+

Bacilles

S. paratyphi A

Gélose Hektoen

_

Coccobacilles

S. flexneri

Shigelles
Salmonelles (SS)

_

Coccobacilles

E. coli

Gélose Hektoen

_

Bacilles

Fig. 20: Aspect des souches bactériennes repiquées sur milieux spécifiques. - Confirmation des souches de S. aureus

Test catalase

Ensemencer des boîtes de gélose Chapman par l'inoculum. Incuber entre 33 et 37 °C pendant 24 à 48 h. Les colonies jaunes entourées d'une zone jaune, sont des Staphylocoques.

Colonies jaunes + H2O2 Effervescence (Catalase +)

H2O2 CATALASE H2O + 1/2 O2

L'effervescence se traduit par un dégagement gazeux, ce qui signifie que cette souche est à catalase +.

Le deuxième test qui confirme la souche de S. aureus fait appel au test coagulase libre. Test coagulase libre (ou épreuve de la coagulase)

Parmi les cocci à Gram+ et catalase+, les souches de S. aureus provoquent la coagulation du plasma oxalaté de lapin en 24 h, les autres espèces et sous-espèces de staphylocoques d'origine humaine ne possèdent pas la coagulase libre sauf S. schleiferi subsp. coagulans (DELARRAS, 2007).

Mélanger dans un tube à hémolyse stérile 0,1 mL de plasma de lapin et 0,3 mL de la culture en bouillon de la souche. Incuber le mélange incliné à l'étuve 37 °C. Les lectures se font après 6 h, 8 h et 24 h d'incubation.

Il a été remarqué qu'après 6 h d'incubation, le plasma a été entièrement coagulé avec prise de masse. Selon les résultats obtenus (coloration de Gram, tests de catalase et coagulase), la souche de Staphylococcus était bel et bien S. aureus.

La confirmation du reste des souches bactériennes n'a pas été effectuée car on ne dispose pas de réactifs nécessaires pour réaliser la galerie biochimique.

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