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L'amélioration génétique du cacaoyer. Des ressources génétiques forestières aux variétés cultivées

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par Philippe LACHENAUD
Université Montpellier II - Habilitation à  diriger des recherches 2010
  

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5.2.4 Les travaux envisagés

Concernant la caractérisation et l'évaluation des cacaoyers de Guyane, les activités suivantes seront menées dans le cadre du projet :

- Identification (sur la base de critères morphologiques) de souches locales de Phytophthora pathogènes du cacaoyer (P. palmivora et P. capsici). Isolement et mise en culture des souches pour leur caractérisation moléculaire. Stratégie identique pour M. perniciosa et C. fimbriata. (à réaliser en Guyane par un étudiant de niveau M1 de l'Université Antilles-Guyane).

- Evaluation (au laboratoire) d'environ 190 génotypes guyanais pour leur résistance aux Phytophthora, sur disques de feuilles (et sur cabosses détachées pour un échantillon de clones résistants). Tests en pépinière sur les mêmes génotypes pour la résistance à M. perniciosa. (par dépôt d'une goutte gélosée d'inoculum). Test sur baguettes des mêmes génotypes pour l'évaluation de la résistance à C. fimbriata. Test au pénétromètre pour évaluer la dureté des cabosses (à réaliser en Guyane).

- Transfert du matériel végétal résistant et/ou intéressant pour d'autres critères au Cirad à Montpellier pour l'évaluation de son niveau de résistance vis-à-vis de P. megakarya (espèce très dangereuse mais non présente en Amérique), et également de souches plus agressives de M. perniciosa originaires d'autres pays d'Amérique, voire de souches de Lasiodiplodia sp. (à réaliser à Montpellier, en partie par un étudiant M1).

5.2.5 Les protocoles expérimentaux

Tous les protocoles devront faire l'objet d'une adaptation locale ; voici, dans l'état actuel des connaissances, ce que l'on peut proposer :

A) Evaluation de la résistance aux Phytophthora - Clones de cacaoyers à tester

L'étude concernera la parcelle S5 de la station de Combi, installée sous ombrière artificielle. 191 objets seront testés, dont 186 clones de cacaoyers spontanés guyanais. Les autres origines sont représentées par deux témoins de résistance (SCA 6, répété deux fois, et T 60/887) et GF 24, un clone guyanais "Primitif" (cloné dans les variétés anciennement cultivées) déjà inclus dans un essai multilocal CFC/ICCO/IPGRI. Les témoins de sensibilité sont deux clones spontanés guyanais, déjà testés à Montpellier.

- Témoins Résistants : SCA 6 et T 60/887

- Témoins Sensibles : ELP 40-B (répété deux fois) et OYA 2-B

- Matériel fongique : souches de Phytophthora spp.

On utilisera des souches locales (testées pour leur virulence) de P. palmivora et de P. capsici.

- Culture des souches : la culture des souches se réalise sur milieu gélosé PDA ou V8 en boîtes de Petri ou tubes de verre. La température de stockage doit être comprise entre 20 et 25°C, à l'obscurité.

- Maintien du pouvoir pathogène : l'alternance, tous les 6 mois, entre culture en boîtes de Petri et en tubes de verre permet généralement de maintenir l'agressivité des souches. Toutefois, si une perte d'agressivité d'une souche était constatée, il faudrait alors inoculer cette souche sur des cabosses matures vertes, puis l'isoler à nouveau sur milieu spécifique, en boîtes ou en tubes, à 25°C et à l'obscurité.

- préparation de l'inoculum : 10 jours avant la date prévue d'inoculation, les souches à inoculer (3 ou 4) sont repiquées sur milieu V8 + betasitostérol gélosé en boites de Petri (diamètre : 10 cm). Les boites sont placées pendant 3 jours à 25°C et à l'obscurité. Puis elles sont placées à 25°C et à la lumière (photopériode 12h/12h) afin d'obtenir la formation des sporocystes qui seront à l'origine de la production des zoospores.

- Inoculation, incubation, notation des symptômes

Le jour de l'inoculation, 4 à 5 ml d'eau distillée stérile seront rajoutés dans chaque boîte. Les boîtes seront alors placées dans un réfrigérateur à 4°C pendant 30 mn. Le choc froid favorise la libération de zoospores contenues dans les sporocystes. Les boîtes sont ensuite placées à 20°C pendant 2 heures pour que les zoospores puissent être relâchées dans l'eau. Puis, pour chaque souche, la solution contenant les zoospores est récupérée dans un bécher. Un comptage des zoospores est fait grâce à une cellule de Malassez. La suspension de zoospores sera diluée afin d'obtenir une concentration de 300 000 zoospores / ml.

L'inoculation avec la suspension calibrée doit se faire le plus rapidement possible afin d'éviter que les zoospores ne perdent leur capacité à nager dans l'eau.

L'évaluation de base comprendra 5 à 6 répétitions, séparées par au moins un mois. Il s'agira en fait de séries, car il est probable que certains clones manqueront à chaque série.

Lors de chaque répétition, on utilisera :

- Une feuille par clone (on s'efforcera de prendre tous les clones lors de chaque répétition), avec à chaque fois les témoins de résistance et de sensibilité) au stade 3, c'est-à-dire des feuilles de 50 à 60 jours, cueillies le matin (6h30- 9h00), stockées en glacière et rapportées au laboratoire le plus rapidement possible.

- 20 disques par feuille (10 pour P. palmivora, 10 pour P. capsici), déposés face inférieure vers le haut. Dans chaque bac, chaque clone sera représenté par deux disques (un pour P. palmivora et 1 pour P. capsici). Lors de chaque répétition, la disposition des disques sera la même dans chaque bac (d'où la nécessité de faire un plan lors du placement des disques).

- 1 gouttelette de 10 uL par disque, déposée avec une micro-pipette à répétition. - Durée d'incubation : 7 jours à 25°C et à l'obscurité

- Lecture des symptômes suivant une échelle de 0 à 5 :

0 : absence de symptômes

1 : minuscules points nécrotiques (= points de pénétration)

2 : points nécrotiques nombreux (points en réseau)

3 : taches se rejoignant (taches en réseau)

4 : grandes taches uniformes (marbrées)

5 : très grandes taches nécrotiques, dépassant parfois les limites de la goutte d'inoculation (taches vraies).

Dans un deuxième temps (ou à Montpellier), quelques répétitions de confirmation seront effectuées avec une concentration élevée (>1.0 million de zoospores /ml) pour les clones classés "Très résistants" après les tests de base.

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9Impact, le film from Onalukusu Luambo on Vimeo.



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