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Régénération via l'organogénèse ou l'embryogénèse somatique chez le Scorpiurus

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par fatima zohra hamdani
Univeristé hassiba ben bouali de chlef - magister 2001
  

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2- La MICROPROPAGATION

La multiplication végétative par culture in-vitro ou micropropagation présente plusieurs avantages sur les méthodes classiques dites " conventionnelles "de propagation . Cette technique a rendu possible la multiplication d'espèces chez lesquelles les semences sont rares, ou présentant des difficultés de germination et/ou dont les techniques de bouturage ou de greffage sont inapplicables , ce qui a conduit à une plus grande diversité des plantes commercialisées.

De même plusieurs autres techniques, toutes dérivées de la culture in-vitro ,ont un rôle important à jouer dans l'amélioration des performances agronomiques ou horticoles des plantes cultivées. La micropropagation est utilisé dans un but de multiplication en masse , puisqu'elle permet , en partant d'un seul individu (plant), l'obtention d'un nombre considérable de plantes génétiquement identiques à la plante mère ( FERRY et al.,1998; SEMAL,1998). Les plants reproduits ne sont pas seulement conformes mais présentent aussi une grande uniformité.

Par ailleurs, l'usage de cette technique nécessite peu d'espace et peu être programmé indépendamment des saisons. La technique représente donc sans contexte un outil puissant aux perspectives industrielles et économiques importantes (MARGARA,1982; BOXUS,1995; SEMAL,1998; SKIRVIN et al., 2000) .

Les techniques de micropropagation empruntent essentiellement deux voies ,

· L'une qui utilise des tissus méristématiques (méristème ou apex de tige, bourgeons axillaires ) potentiellement capable de donner suite, au développement normal, d'un individu est appelée microbouturage (SAADI,1991) cette technique est souvent appelée "multiplication conforme" car elle part de méristème préexistant dans les quels , les cellules sont génétiquement très stables (AMATO,1977 in BOXUS,1995),l'individu est généralement obtenu en deux étapes successives, d'abord la production de tige ,puis son enracinement .

· L'autre voie, utilise toute sorte tissus différenciés (fragments de tige, de racines, de pétiole , de feuilles, d'embryons matures et immatures ,d'hypocotyles, cotylédons...etc) pour aboutir à la néoformation soit de bourgeons ou de racines , c'est l'organogenèse ,soit de structures ressemblant aux embryons zygotiques, c'est l'embryogenèse somatique (ZRYD,1988 ; MARGARA,1989).

2.1- Cultures de méristèmes

les premiers résultats de cultures de méristèmes appelées communément "cultures d'apex" furent obtenus par KOTTE et ROBBINS, dés 1922 à partir de méristème radiculaires de fève et de maïs( TOUTE,1998).

Dix ans plus tard, WHITE(1934) obtiendra une culture indéfinie de racines de tomate . En même temps, il s'apercevait que si le virus de la mosaïque du tabac pouvait se multiplier dans des racines de tomate isolées , le virus n'atteignait pas les cellules méristématiques . Plus tard , LIMASSET et CORNUET(1949) montrent que les organes jeunes de tabac ne renferment que très peu de virus (TMV) et que les méristèmes apicaux n'en contiennent pas .

En 1952, partant de ces observations, MOREL et MARTIN tentent de prélever des pointes méristèmatiques de dahlias viroses pour reproduire des dahlia génétiquement semblables aux parents, mais exempts de virus . Ils réussiront de la sorte à éliminer la mosaïque du dahlia et le " spotted wilt virus". En 1955 , ils régénéreront de façons analogue des pommes de terre atteintes de virus A et Y (BOXUS, 1995).

Depuis lors , la culture de méristèmes à conduit à des applications nouvelles , originales concernant le domaine du phytosanitaire, notamment pour l'éradication de nombreuses maladies (viroses, mycose, mycoplasmoses, bactérioses) et a permis la régénération d'un grand nombre d'espèce saines (TOUTE, 1998).

Les méristèmes qui sont des tissus de formation, en expansion continue ,confèrent à la plante une organogenèse permanente chez les végétaux supérieurs. Ils représentent des petits massifs de cellules indifférenciées (0.1mm) et conservent la capacité de se diviser activement. Ces zones méristèmatiques gardent jusqu'à leur mort le caractère juvénile. Elles jouent un rôle capital dans le développement végétal puisqu'elle édifient tous les organes (CAMEFORT, 1977; MARGARA, 1989).

En multipliant le méristème prélevé au sommet d'une plante ou dans le bourgeon axillaire, le plus souvent indemne de maladies. On pourra très rapidement obtenir de nombreuses plantes, toutes semblables du point de vue génétique et débarrassées de maladies dont elles étaient affectées (SCHMID et KELLER, 1984; SAMA et al., 1998;). Il est même possible de reconstituer des clones indemnes de maladies à partir de pieds -mères malades. D'après TOUTE, 1998; FLETCHER et al. ,1998 , il existe plus de 50 espèces végétales qui ont été ainsi assainies c'est le cas de la pomme de terre , la canne à sucre , de dahlia ..etc .

La culture de méristème est la méthode la plus généralisable et la plus sûre pour éviter l'apparition de plantes non conformes à la plante mère ou variants (SAADI, 1991) . Elle paraît plus intéressante chez les plantes allogames ou il est généralement impossible de conserver des génotypes intacts par reproduction sexuée classique.

2.2- Organogenèse

l'organogenèse est la base fondamentale de la multiplication végétative , laquelle s'appuie toujours sur la formation de méristèmes nouveaux (MARGARA,1989). En partant d'un explant , elle aboutit à la formation d'un nouvel individu par l'élaboration de bourgeons (caulogenèse ) et de racine (rhizogenèse).

2.2.1-Caulogenèse

2.2.1.1 Définition

La caulogenèse désigne à la fois l'initiation et le développement des bourgeons terminaux, axillaires, adventifs ou néoformés sur un cal.

· Les bourgeons terminaux dérivent de la gemmule de l'embryon.

· Les bourgeons axillaires sont produits généralement par les deux ou trois assises cellulaires superficielles de la tige.

· Les bourgeons adventifs sont formés en des endroits inhabituels. Ils sont formés à partir d'organes différenciés de la plante (entre noueds, tubercules, racines). Ils peuvent avoir pour origine des massifs cellulaires restés méristèmatiques ou bien provenir d'une différenciation de certaines cellules(CAMEFORT, 1977).

· Les bourgeons néoformés in-vitro peuvent apparaître sur l'explant initial ou sur un cal, ils peuvent être considérés comme un cas particulier de bourgeons adventifs BOXUS, 1995). Ils sont induits sur n'importe quel type d'organe ou de tissu y compris sur ceux qui ne les produisent pas dans les conditions naturelles (CAMEFORT, 1977; ZRYD, 1988; MARGARA, 1989).

2.2.1.2 Origine des bourgeons

Les études cytologiques, conduites dans le but de déterminer l'origine des bourgeons néoformés à partir d'un fragment d'organe contenant divers tissus montrent souvent que l'aptitude à la caulogenèse se manifeste à partir de certaines catégories de tissus telle que: le cambium ,le parenchyme vasculaire ou libérien (BELANGER, 1998; FORTES et PAIS, 2000).

L'intensité de cette néoformation est nettement dépendante de la nature des tissus contenus dans l'explant. Elle est maximale pour les tissus cambiaux, élevée pour les tissus du phloème et du xylème, très faible ou nulle pour le parenchyme cortical ou médulaire (MARGARA, 1989) .

Chez les conifères, comme le pin , les premières divisions périclines apparaissent dans les couches subépidermiques du mésophylle, l'origine des pousses caulinaires parait être unicellulaire. Par contre chez les Angiospermes, l'origine peut être pluricellulaire, des méristèmes peuvent se former à partir de cellules épidermique ou encore à partir de tissus palissadiques, du mésophylle spongieux ou de la gaine perivasculaire des explants cultivés (BOXUS, 1995).

2.2.2 Rhizogenèse

2.2.2.1 Définition

La rhizogenèse désigne la néoformation et la croissance de racine. Les méristèmes de racines se répartissent en plusieurs catégories selon leurs origines.

· Les racines latérales se forment de manière spontanée sur la racine principale dans les conditions naturelles.

· Les racines adventives sont produites par des organes divers, soit spontanément, soit accidentellement à la suite d'une blessure ou d'une manière provoquée, dans les conditions du bouturage et du marcottage.

· Les racines néoformées, au sein d'un cal, en culture in-vitro, peuvent être considérées comme un cas particulier de méristèmes adventifs (rhizogenèse indirecte) ou l'émission de racines sur un explant dans des endroits inhabituelles (rhizogenèse directe).

2.2.2.2- Origine des racines néoformées

La rhizogenèse est un phénomène complexe, il comporte différentes phases : la dédifférenciation, formation d'amas de cellules méristèmatiques , différenciation et organisation des amas méristèmatiques en primordium racinaire qui se développeront en jeunes racines ( MARGARA , 1989; BOXUS, 1995).

L'origine des cellules impliquées dans la cicatrisation dépend de l'espèce. FAVRE (1985) inBOXUS,(1995)sur son modèle vigne relève que ce sont les cellules du phloème primaire qui réagissent les premières. Les cellules non lignifiées d'origine secondaire et le parenchyme cortical, ou même la moelle peuvent également réagir en formant un tissu cicatriciel plus ou moins important. Mais dans tous les cas, c'est l'assise génératrice libéro- ligneuse ( combium) qui donne, des tissus de bonne aptitude callogène. Le cal est formé essentiellement de cellules de type méristèmatique secondaire, qui incorporent certaines cellules voisines parenchymateuses . Les cellules méristèmatiques se différencient par la suite et s'organisent pour donner naissance à une nouvelle racine.

2.3-Embryogénèse somatique

2.3.1-Définition

Classiquement, l'embryon est défini comme étant une plante se trouvant au stade initial de son développement. Il s'agit en fait d'une structure bipolaire ( munie de deux méristèmes : l'un caulinaire et l'autre racinaire) qui, suite au processus de germination, donne naissance à une nouvelle plante.

Habituellement, l'embryon s'édifie à partir d'une cellule initiale, le zygote, formé lors de la reproduction sexuée (embryon zygotique) .

Cependant, d'autres types d' embryons peuvent également se développer à partir de cellules du sporophyte ou du gamétophyte, embryons qui ne sont pas le produit d'une fusion gamétique et qui sont appelés "embryons somatiques" . Parfois, chez certains espèces, ils résultent d'une embryogenèse somatique naturelle qualifiée d'apomixie . Dans certains cas en effet, les anthérozoîdes , l'oosphère , voire d'autres cellules gamétophytiques peuvent engendrer des embryons parthénogénétiques. Dans d'autres cas, certaines cellules sporophytiques localisées au niveau des tissus intra-ovulaire, en particulier le nucelle, fournissent naturellement des embryons apoméiotiques appelés aussi "embryons nucellaires. Ce type d'embryogenèse est très développé dans la famille des Rutacées, spécialement chez les Citrus (TISSERAT et al., 1979;VARDI et al., 1990) Toutefois, cette appellation est essentiellement appliquée , selon certains auteurs comme PIATTI, (1988) et MARGARA, (1989), aux embryons obtenus à partir de culture de tissus in-vitro du sporophyte .

2.3.2 - Origine et développement des embryons somatiques

Les donnés cytologiques montrent que les embryons somatiques ont pour origine des cellules particulières; dites embryogènes. Elles présentent des caractères de cellules méristèmatiques primaires: petites tailles, cytoplasme dense, gros noyaux aux nucléoles proéminents et petites vacuoles.

Elles fixent de manière intense les colorants ce qui les rend aisément repérables en cytologie(JULLIEN, 1991 ;LOISEAU et al .,1998; VASLENKO et al, 2000).

Selon SHARP et al (1980)in PIATTI (1988)décrivent deux voies pour l'embryogenèse somatique:

La première dite est l'embryogenèse directe où les embryons sont initiés à partir de tissus en absence de prolifération de cal. Ceci se produit à partir des cellules pré-embryogéniques déterminées (P.E.D.C) ou les cellules sont déjà engagées dans un développement embryogène et ils ont besoins seulement d'être libérées (PIATTI,1988; ROUGET,1989). Elle semblent préexister dans les tissus de certains explants comme les embryons immatures ou les fragments de très jeunes plantes (SAADI, 1991) .

La seconde dite est l'embryogenèse somatique indirecte, pour la quelle une prolifération cellulaire est requise. Les travaux de SHARP (1980) et d'EVANS (1981) in PIATTI(1988) ont également pu servire à mettre en évidence, l'existence de cellules initiatrices qui sont déjà différenciées mais dépourvues de capacité embryogènes. Ils les nomment des cellules pré-embryogènes indéterminées(PEIC).Les cellules embryogènes apparaissent tardivement au sein du cal produit par la réactivation mitotique des cellules différenciées et/ ou la prolifération des cambiums obtenus à partir d'explants de type racines, tige ou de feuille(JULLIEN,1991 ; RUGKHLA et JONES , 1998)). Leurs multiplications aboutit à la formation de groupes de cellules embryogènes "nodules méristèmatiques" dispersés, parmi les autres cellules du cal et qui sont généralement de type parenchymateux. A la suite de leur repiquage sur des milieux dépourvus d'auxines, ces nodules évoluent en des embryons somatiques comme c'est le cas chez la carotte (SAADI,1991).

Les embryons somatiques connaissent les même stades de développement morphlogiques que traversent habituellement les embryons zygotiques à savoir : stade globulaire, cordiforme, torpille et cotylédonaire(EGERTSDOTTER et ARNOLD , 1998). Ils ont une structure chromosomique souvent semblable à celle de la plante- mère dont ils sont issus (NUTI RANCHI, 1995) . Le critère qui permet de reconnaître un embryon somatique est certainement sa structure bipolaire, qui développe précocement et simultanément un méristème caulinaire et un méristème racinaire (NORREL, 1973 ; NUTI RANCHI , 1990).

2.3.3 Intérêt de l'embryogenèse somatique

Historiquement , les premiers embryons somatiques ont été signalés, en 1958, par l'équipe de REINERT & STUART sur des cultures du parenchyme libérien de racine de carotte (BELANGER, 1998).Depuis et grâce au progrès spectaculaire que connaît les techniques de cultures in-vitro, la production d'embryons somatiques est devenue possible chez un grand nombre d'espèces végétales.

Comparativement aux autres voies de multiplication végétative in-vitro , l'embryogenèse somatique se montre plus séduisante en terme de performance et d'efficacité (HARKMAN et ARNOLD , 1985 ; PIATTI, 1988). En effet, la maîtrise de la production d'embryons, chez certaines espèces, via les suspensions cellulaires permet d'obtenir des milliers d'embryons par litre de milieu de culture et par conséquent la régénération de milliers de plants. L'embryogenèse somatique permet aussi en un temps très court de produire des plantes entières sans passer par les contraintes que connaît habituellement l'organogenèse ( phase de caulogenèse et de rhizogenèse) (DAIKH et DEMARLY, 1987 ; ROGUET, 1989).

La voie de l'embryogenèse somatique est actuellement intégrée dans de nombreux schémas de sélection puisqu'elle permet de diminuer sensiblement la longueur des cycles d'amélioration comme par exemple , le temps nécessaire à la valorisation du matériel sélectionné âgé ou juvénile ou la production de parents hybrides nécessaires à la diffusion de nouvelles variétés (DEMARLY et SIBI, 1989 ; DEMARLY, 1994; STANANTINO et al., 1998; LOISEAU et al., 1998; TREMBLAY et al., 1999). De telles applications ont été réalisées chez plusieurs espèces comme le café (CARNEIRO, 1999) ; la carotte (TOUTE,1998); la luzerne (REDENBOUGH et al., 1986 FUJII et al., 1987 ; STUART et al., 1987 ; RAY et BINGHAM, 1989) ;Asparagus officinalis (MAMIYA et SAKAMOTO , 2001); le palmier dattier (FERRY et al, 1998) et le palmier à huile (RIVAL et al., 1998).

2.4 Facteurs de la régénérabilité

Les facteurs influant sur la régénérabilité in-vitro peuvent être schématiquement répartis en 2 groupes ( figure 2) . Le premier représente Les facteurs internes , ( ceux liés à la plante) et concerne d'une part le génotype , la nature et l'âge ontogénique de l'explant et d'autre part l'état physiologique de la plante mère sur laquelle, l'explant a été prélevé . Le second réunit les différents facteurs externes qui englobent et les milieux (notamment leur composition en régulateurs de croissance et les sucres ) et les conditions de cultures.

2.4.1- Effet de l'explant

Un des atouts  majeurs de la culture in-vitro est de montrer que des cellules somatiques (à 2n chromosomes) , pouvaient produire , soit des structures comparables à des embryons somatiques, soit à des bourgeons et dont le développement permet de régénérer des plantes conformes à la plante mère . Pratiquement, n'importent quel organe(bourgeon, racine, feuille, anthère, etc.) ou fragment d'organe (explant), prélevé sur celle-ci , peut être cultivé isolément sur milieu nutritif synthétique, mais le choix de celui-ci est d'une importance primordiale . On retiendra cependant que la réponse in-vitro est sous la dépendance de nombreux facteurs .

· L'age physiologique et ontogénique de l'organe

Généralement dans les cultures in-vitro ,on privilégiera les explants les plus jeunes (embryons immatures , jeunes feuilles , méristèmes etc.) car c'est l'état juvénile qui semble offrir le plus de possibilités de régénération ( DAVIS, 1986.,SAADI, 1991). Souvent , ce sont les tissus provenant d'embryons qui expriment le plus souvent, d'une manière nette et reproductible, l'aptitude à la régénération, .C'est le cas par exemple du pois (SAADI, 1991); du lupin (DESIRE, 1988) , du coton (BRAR et al. , 1998) ; du soja (SANTAREM et al ., 1997); du tournesol(CHARNIERE et al., 1999) ; Pinus sylvestris ( HAGGMAN et al ., 1999) et bien d'autres espèces.

Figure 2 : Les facteurs influants sur l'aptitude à régénérer in-vitro

· L'époque du prélèvement

Ce problème se pose surtout pour les espèces vivaces, on peut distinguer un stade de vie active et un stade de vie ralentie de la plante ce qui conduit les explants à développer des réactions différentes en culture in-vitro. Cette différence peut être expliquée par la modification des équilibres internes des régulateurs de croissance (auxines, cytokinines, gibbérelline ...) lors des différentes saisons (AUGE et al., 1989) .

· La taille de l'explant

Plus la taille est importante et plus les équilibres endogènes sont déterminants et les conditions extérieures seront influentes . La taille choisie variera selon la nature de l'explant . si le tissu végétal est de nature organisée , un ensemble assez complet sera nécessaire ( soit un noeud , un apex , ou un bourgeon entier ) mais dans le cas d'une structure différenciée ( éléments de feuilles , de tige, de racines ,inflorescence..) des fragments de 5à 10 mm suffiront ( ZRYD, 1988., AUGE et al ., 1989; HANNWEG et al ., 1996).

D'une manière générale, il existe des tissus privilégiés appelés «tissus cibles » qui répondent à un stimulus indicateur qui orientera son programme morphogénétique vers une voie particulière de développement contrairement à certains tissus récalcitrants aux manipulations in-vitro, dues essentiellement à un manque de compétence cellulaire(COLEMAN et ERNST, 1990 ; NUTI RONCHI, 1995 ; YADAV et RAJAM , 1998).

2.4.2-Influence du génotype

La plupart des plantes montrent une régénération génotypique spécifique liée à l'espèce. A l'intérieur d'une même espèce, un génotype donne des bourgeons tandis qu'un autre ne peut fournir que des embryons(AUGE et al ., 1989) . Cependant, plusieurs auteurs mentionnent que seulement certains génotypes paraissent posséder la capacité d'induire une embryogenèse somatique . Cette capacité, chez beaucoup d'espèce semble être génotypiquement contrôlé ( GEORGE et SHERRINGTON , 1984 ., BROWN, 1988 ; DODEMAN et al ., 1997 ) .

Un tel contrôle de la régénération ( par la voie de l'embryogenèse somatique ou de la caulogenèse ) a été rapporté chez les Légumineuses fourragères est spécialement chez la luzerne par BROWN et ATANASSOV (1985); Trifolium repens par PARROT (1991) et bien d'autres espèces . BENCHEIKH et GALLAIS (1996 ) indiquent la présence de quelques gènes majors pouvant contrôler l'embryogenèse somatique chez le pois. De même BINGHAM et al (1975) ont réussit à augmenter considérablement la fréquence embryogène chez Médicago sativa après deux étapes de sélection récurrente. REISCH et BINGHAM , (1980) trouvent chez un génotype de luzerne diploïde que la différenciation de bourgeons à partir de cal est contrôlée par deux gènes dominants désignés Rn1 et Rn2 dont la présence simultanée permet un taux élevé de régénération ( plus de 75 % des explants) . L'hétérogénéité existante chez les Légumineuses fourragères, permet d'expliquer la facilité à identifier les génotypes favorables à la régénération .

2.4.3-Influence du milieu de culture

Avec le développement des cultures de tissus , divers milieux de base comprenant des sels inorganiques , des composés organiques ( sucres , vitamines et régulateurs de croissances ) ont été progressivement utilisés .Certains milieux proposés dans un but donné sont en fait utilisables d'une manière beaucoup plus étendue.

Les milieux de culture sélectionnés doivent être le plus parfaitement adaptés aux besoins nutritifs de la plante soumise à l'étude afin de laisser s'exprimer pleinement son potentiel génétique.

Les principaux constituants d'un milieu de culture sont généralement représentés par les macro et les micro-éléments, une source carbonée et azotée, des vitamines et des régulateurs de croissance.

Selon EVANS et al , (1981) ,dans 70% des cas , des milieux de culture de base de type MURASHIGE et SKOOG (MS) ont été utilisés. Il a été employer d'une manière générale pour tous les types de cultures in-vitro . Mais c'est essentiellement pour le déclenchement de l'organogenèse , en particulier pour la néoformation de bourgeons que s'est révélé nettement supérieur à d'autres milieux (MARGARA, 1989) c'est le cas du Cunila galioides ( FRACARO et ECHEVERRIGARAY , 2001).

Le milieu de MURASHIGE et SKOOG est caractérisé principalement par une très forte teneur en sels minéraux , en particulier en potassium et par une concentration également élevée en azote (60méq/l environ sous forme de nitrate et d'ammonium ) dont 1/3 apporté sous forme réduite (ionsNH4+); le rapport nitrate / ammonium, dans ce milieu est très favorable à l'induction de l'embryogenèse somatique , en particulier chez Feijoa sellowiana (DEL VESCO et GUERRA , 2001).

Il apparaît à travers la recherche bibliographique que nous avons effectuées , qu'il existe deux composantes majeurs du milieu qui peuvent intervenir dans l'orientation du phénomène de morphogenèse et qui sont représentées par les régulateurs de croissances et la source carbonée.

2.4.3.1-Les régulateurs de croissance

Un régulateur de croissance est défini comme étant, une substance qui, suivant sa concentration absolue ou relative dans le milieu, peut supprimer, permettre ou modifier sous certaines conditions les processus de cytodifférenciations (STREET, 1977).

Aucun régulateur de croissance ne provoque une initiation directe du phénomène d'organogenèse ou d'embryogenèse somatique , mais il interfère dans de nombreux métabolismes internes de la cellule végétale.

l'organogenèse est fortement influencée par les régulateurs de croissance. Les deux hormones, les plus souvent utilisés, d'une manière conjointe ou séquentielle, sont les auxines et les cytokinines. NITSH et NOUGAREDE ,(1967) ont montré que des explants de parenchyme médullaire de tabac cultivés in-vitro dans un milieu ne contenant ni auxine ,ni cytokinine ne prolifèrent pas. Il en était de même lorsque seulement une auxine ou une cytokinine était incorporée au milieu. Par contre , la prolifération cellulaire se déclenchait lorsque ces deux substances sont présentes dans le même milieu de culture.

Le rapport hormonal (auxine/ cytokinine) conditionne, en grande partie, le type de néoformation obtenu. Ce rapport a conduit, dans le cas de la culture in-vitro du parenchyme médullaire de tabac, par exemple , à l'orientation des tissus, soit vers la caulogenèse , soit vers la rhizogenèse (SKOOG et MILLER, 1957 in ZRYD ,1988). Ainsi la néoformation de bourgeons est souvent favorisée par des teneurs élevées en cytokinine (FRETT, 1977; WALKER et al., 1979; MARGARA , 1989; ABRIE et STADN , 2001; COMPTON et al., 2001; TANG et GUO, 2001 )  alors que les fortes doses en auxines stimulent la formation de racines et améliorent leurs qualités (DRUART, 1992, HOBBIE, 1998; ABRIE et STADN , 2001; COMPTON et al., 2001).

L'influence de ce rapport hormonal n'est, cependant , pas une règle générale pour toutes les espèces végétales . En effet, il suffit, dans certains cas, d'ajouter au milieu de culture l'un ou l'autre des deux régulateurs précités pour parvenir à une réponse morphogénétique (SEON et al. , 1998). Dans ce cas précis, nous pouvons citer deux exemples : le premier, concerne le Tritical où l'organogenèse a été obtenue en se servant uniquement d'auxine ( milieu dépourvu de cytokinine) (VIKRANT et RASHID , 2001) ; le second, touche l'espèce Piper barberi gamble où l'équipe d'ANAND et RAO,(2000) a obtenu des bourgeons néoformés en utilisant des cytokinines seules dans le milieu d'induction

Par ailleurs ,il est important de dire, en se basant sur la diversité des réponses obtenues dans ce domaine , qu'il n'existe pas de règle générale, concernant l'efficacité des différentes auxines et cytokinines sur la caulogenèse ou sur la rhizogenèse. Les effets paraissent varier essentiellement avec le matériel végétal employé.

Tout comme l'organogenèse, Les régulateurs de croissance de type auxine et cytokinine sont aussi indispensables à l'embryogenèse somatique.

La production d'embryons somatique est généralement obtenue en deux phases de culture, sur des milieux qui différent essentiellement par leurs concentrations en régulateurs de croissance (AUGE et al., 1989). Par exemple, chez la carotte ou la luzerne, les embryons sont obtenus en deux phases: Une phase dite d'induction réalisé sur un milieu souvent riche en régulateurs de croissance en particulier en auxines permet la formation et / ou la prolifération des cellules embryogènes. Ces cellules n'évolueront en embryons qu'au cours d'une deuxième phase dite de développement qui se réalise au moyen d'un transfert de tissus induits, sur un nouveau milieu moins riche , voir dépourvu de régulateurs de croissance essentiellement en auxines (SAADI, 1991 ; GIORGETTI et al.,1995) .

Cette façon de faire ou plutôt ce schéma de transfert a été appliqué avec succès dans de nombreux travaux de recherche portant sur l'obtention de l'embryogenèse somatique . Nous citons, à titre d'exemple, les travaux réalisés à partir d'embryons immatures de graminées (JULLIEN, 1991) , de pois (SAADI, 1991), de coconut (NAIR et al ., 1999) , de Pinus sylvestris ( HAGGMAN et al ., 1999) , d'Arabidopsis thaliana ( GAJ, 2001 ) ; de boutons floraux du bananier (ESCALANT et al., 1994) ; d'hypocotyles du tournesol (LAPARRA et al., 1997) ; des feuilles du Santalum album et Santalum spicatum (RUGKHLA et JONES , 1998); etc...

Le transfert des tissus d'un milieu riche en auxine vers un milieu pauvre n'est pas toujours indispensable pour le déroulement des différentes phases annoncées précédemment. L'exemple des travaux de MAHESWAREN et WILIAMS, (1984), portant sur l'embryogenèse du trèfle et la luzerne, est très significatif puisqu'ils ont réussi à obtenir, des embryons somatiques, directement sur les explants d'embryons immatures cultivés sur un milieu riche en cytokinine et totalement dépourvu d'auxine. C'est l'exemple aussi des travaux de KRISTEN et al., 2000 réalisés sur les explants de pétioles de Echinecea purpurea L

Par contre d'autres cultures exigent en phase inductive, la présence conjointe d'une auxine et d'une cytokinine, c'est le cas de la luzerne (JULLIEN, 1991); du papayer (MONMARSON et al., 1994); du cocotier (SERGE, 1998) ; du caféier (CARNEIRO, 1999) et bien d'autres espèces.

Il est utile de rappeler , que les auxines les plus souvent utilisées en organogenèse ou en embryogenèse somatique sont le 2,4-D, l'AIA, l'AIB et l'ANA. A cause de son bon pouvoir inducteur, le 2,4 -D semble détenir, d'après EVANS et al., 1981, le record d'utilisation dans les études portant sur l'embryogenèse somatique (puisque 57 % des travaux de recherche l'utilisent comme régulateur). Quand aux cytokinines , elles sont représentées par la Kinétine, , la benzyladenine (BA), la 2- isopentenyladénine et la zéatine.

Outre, les auxines et les cytokinines, d'autres régulateurs de croissance peuvent intervenir dans le processus d'organogenèse ou d'embryogenèse somatique tels que les gibbérellines et l'acide abscissique (ABA) ; cependant, leur utilisation reste limiter . Les gibbérellines, selon JAYASREE et al, 2001, stimulent fortement la production de bougeons néoformés chez la pomme de terre lorsqu'elles sont combinées aux cytokinines. Par contre, d'après MARGARA, 1989, les gibberellines ont la réputation d'inhiber l'organogenèse et particulièrement la rhizogenèse chez le Chou-fleur.

L'acide abscissique (ABA) quant à lui, est employé par certains auteurs dans le but de corriger ou d'améliorer la qualité morphologique des embryons (UNNIKRISHAN et al., 1990 ; DODEMAN et al., 1997). Son usage peut inhiber, en même temps, le déclenchement éventuel d'une embryogenèse secondaire et empêche la germination précoce des embryons somatiques MILENA et al., 1998; SVOBODOVA et al ., 1999).

2.4.3.2-Influence de la source carbonée

Les tissus en cultures in-vitro sont largement hétérotrophes via à vis du carbone en raison de l'absence ou de l'insuffisance de l'assimilation chlorophyllienne. Il est donc indispensable d'ajouter une source carbonée (des glucides) au milieu de culture. Les glucides remplissent deux fonctions principales dans les milieux de culture ; ils fournissent de l'énergie nécessaire pour la croissance des tissus et maintiennent une pression osmotique donnée du milieu de culture (ZRYD, 1988). Cette pression osmotique, appelée aussi « effet osmoticum , peut avoir diverses actions sur les tissus. Elle agit , dans certains cas , sur l'orientation ou l'expression morphogénétique des tissus (BELAIZI et BOXUS, 1995; CHARNIERE et al., 1999), dans d'autres , sur la maturation des embryons somatiques produits (WALKER et PARROTT, 2001) . 

Les glucides, les plus généralement utilisés sont le saccharose et le glucose (MARGARA,1989; DRUART et SAMYN,1995). Selon certains auteurs, le maltose peut constituer une bonne source carbonée puisqu'il permet , dans certains travaux portant sue l'embryogenèse, d'améliorer à la fois, et la qualité et la quantité des embryons somatiques produits ( SAADI , 1991).

L'organogenèse ou l'embryogenèse somatique ne semblent pas être influencées uniquement par la nature des sucres mais aussi, et pour un même sucre, par sa concentration dans le milieu de culture. Généralement, selon PIATTI, 1988, les doses employées oscillent entre 2 et 12 %.

L'effet dose peut avoir, comme nous l'avons signalé ultérieurement, une grande influence sur le devenir morphogénétique des cultures. Dans ce cas , l'exemple du tournesol est très significatif, l'usage d'une concentration de 12% en saccharose peut orienter le processus vers la voie de l'embryogenèse somatique, alors qu'une concentration de 3 % conduirait vers la néoformation de bourgeons (CHARNIERE,1999).

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