2- La MICROPROPAGATION
La multiplication végétative par culture
in-vitro ou micropropagation présente plusieurs avantages
sur les méthodes classiques dites " conventionnelles "de propagation .
Cette technique a rendu possible la multiplication d'espèces chez
lesquelles les semences sont rares, ou présentant des difficultés
de germination et/ou dont les techniques de bouturage ou de greffage sont
inapplicables , ce qui a conduit à une plus grande diversité
des plantes commercialisées.
De même plusieurs autres techniques, toutes
dérivées de la culture in-vitro ,ont un rôle
important à jouer dans l'amélioration des performances
agronomiques ou horticoles des plantes cultivées. La micropropagation
est utilisé dans un but de multiplication en masse , puisqu'elle
permet , en partant d'un seul individu (plant), l'obtention d'un nombre
considérable de plantes génétiquement identiques à
la plante mère ( FERRY et al.,1998; SEMAL,1998). Les plants
reproduits ne sont pas seulement conformes mais présentent aussi une
grande uniformité.
Par ailleurs, l'usage de cette technique nécessite
peu d'espace et peu être programmé indépendamment des
saisons. La technique représente donc sans contexte un outil puissant
aux perspectives industrielles et économiques importantes (MARGARA,1982;
BOXUS,1995; SEMAL,1998; SKIRVIN et al., 2000) .
Les techniques de micropropagation empruntent essentiellement
deux voies ,
· L'une qui utilise des tissus
méristématiques (méristème ou apex de tige,
bourgeons axillaires ) potentiellement capable de donner suite, au
développement normal, d'un individu est appelée microbouturage
(SAADI,1991) cette technique est souvent appelée "multiplication
conforme" car elle part de méristème préexistant dans les
quels , les cellules sont génétiquement très stables
(AMATO,1977 in BOXUS,1995),l'individu est généralement obtenu en
deux étapes successives, d'abord la production de tige ,puis son
enracinement .
· L'autre voie, utilise toute sorte tissus
différenciés (fragments de tige, de racines, de pétiole ,
de feuilles, d'embryons matures et immatures ,d'hypocotyles,
cotylédons...etc) pour aboutir à la néoformation soit de
bourgeons ou de racines , c'est l'organogenèse ,soit de structures
ressemblant aux embryons zygotiques, c'est l'embryogenèse somatique
(ZRYD,1988 ; MARGARA,1989).
2.1- Cultures de
méristèmes
les premiers résultats de cultures de
méristèmes appelées communément "cultures d'apex"
furent obtenus par KOTTE et ROBBINS, dés 1922 à partir de
méristème radiculaires de fève et de maïs(
TOUTE,1998).
Dix ans plus tard, WHITE(1934) obtiendra une culture
indéfinie de racines de tomate . En même temps, il s'apercevait
que si le virus de la mosaïque du tabac pouvait se multiplier dans des
racines de tomate isolées , le virus n'atteignait pas les cellules
méristématiques . Plus tard , LIMASSET et CORNUET(1949) montrent
que les organes jeunes de tabac ne renferment que très peu de virus
(TMV) et que les méristèmes apicaux n'en contiennent pas .
En 1952, partant de ces observations, MOREL et MARTIN
tentent de prélever des pointes méristèmatiques de dahlias
viroses pour reproduire des dahlia génétiquement semblables aux
parents, mais exempts de virus . Ils réussiront de la sorte à
éliminer la mosaïque du dahlia et le " spotted wilt virus". En
1955 , ils régénéreront de façons analogue des
pommes de terre atteintes de virus A et Y (BOXUS, 1995).
Depuis lors , la culture de méristèmes à
conduit à des applications nouvelles , originales concernant le domaine
du phytosanitaire, notamment pour l'éradication de nombreuses maladies
(viroses, mycose, mycoplasmoses, bactérioses) et a permis la
régénération d'un grand nombre d'espèce saines
(TOUTE, 1998).
Les méristèmes qui sont des tissus de formation,
en expansion continue ,confèrent à la plante une
organogenèse permanente chez les végétaux
supérieurs. Ils représentent des petits massifs de cellules
indifférenciées (0.1mm) et conservent la capacité de se
diviser activement. Ces zones méristèmatiques gardent
jusqu'à leur mort le caractère juvénile. Elles jouent un
rôle capital dans le développement végétal
puisqu'elle édifient tous les organes (CAMEFORT, 1977; MARGARA, 1989).
En multipliant le méristème
prélevé au sommet d'une plante ou dans le bourgeon axillaire, le
plus souvent indemne de maladies. On pourra très rapidement obtenir de
nombreuses plantes, toutes semblables du point de vue génétique
et débarrassées de maladies dont elles étaient
affectées (SCHMID et KELLER, 1984; SAMA et al., 1998;). Il est
même possible de reconstituer des clones indemnes de maladies à
partir de pieds -mères malades. D'après TOUTE, 1998; FLETCHER et
al. ,1998 , il existe plus de 50 espèces
végétales qui ont été ainsi assainies c'est le
cas de la pomme de terre , la canne à sucre , de dahlia ..etc .
La culture de méristème est la méthode
la plus généralisable et la plus sûre pour éviter
l'apparition de plantes non conformes à la plante mère ou
variants (SAADI, 1991) . Elle paraît plus intéressante chez les
plantes allogames ou il est généralement impossible de conserver
des génotypes intacts par reproduction sexuée classique.
2.2- Organogenèse
l'organogenèse est la base fondamentale de la
multiplication végétative , laquelle s'appuie toujours sur la
formation de méristèmes nouveaux (MARGARA,1989). En partant d'un
explant , elle aboutit à la formation d'un nouvel individu par
l'élaboration de bourgeons (caulogenèse ) et de racine
(rhizogenèse).
2.2.1-Caulogenèse
2.2.1.1 Définition
La caulogenèse désigne à la fois
l'initiation et le développement des bourgeons terminaux, axillaires,
adventifs ou néoformés sur un cal.
· Les bourgeons terminaux dérivent de la
gemmule de l'embryon.
· Les bourgeons axillaires sont produits
généralement par les deux ou trois assises cellulaires
superficielles de la tige.
· Les bourgeons adventifs sont formés en
des endroits inhabituels. Ils sont formés à partir d'organes
différenciés de la plante (entre noueds, tubercules, racines).
Ils peuvent avoir pour origine des massifs cellulaires restés
méristèmatiques ou bien provenir d'une différenciation de
certaines cellules(CAMEFORT, 1977).
· Les bourgeons néoformés in-vitro
peuvent apparaître sur l'explant initial ou sur un cal, ils peuvent
être considérés comme un cas particulier de bourgeons
adventifs BOXUS, 1995). Ils sont induits sur n'importe quel type d'organe ou de
tissu y compris sur ceux qui ne les produisent pas dans les conditions
naturelles (CAMEFORT, 1977; ZRYD, 1988; MARGARA, 1989).
2.2.1.2 Origine des bourgeons
Les études cytologiques, conduites dans le but de
déterminer l'origine des bourgeons néoformés à
partir d'un fragment d'organe contenant divers tissus montrent souvent que
l'aptitude à la caulogenèse se manifeste à partir de
certaines catégories de tissus telle que: le cambium ,le parenchyme
vasculaire ou libérien (BELANGER, 1998; FORTES et PAIS, 2000).
L'intensité de cette néoformation est nettement
dépendante de la nature des tissus contenus dans l'explant. Elle est
maximale pour les tissus cambiaux, élevée pour les tissus du
phloème et du xylème, très faible ou nulle pour le
parenchyme cortical ou médulaire (MARGARA, 1989) .
Chez les conifères, comme le pin , les premières
divisions périclines apparaissent dans les couches
subépidermiques du mésophylle, l'origine des pousses caulinaires
parait être unicellulaire. Par contre chez les Angiospermes, l'origine
peut être pluricellulaire, des méristèmes peuvent se former
à partir de cellules épidermique ou encore à partir de
tissus palissadiques, du mésophylle spongieux ou de la gaine
perivasculaire des explants cultivés (BOXUS, 1995).
2.2.2
Rhizogenèse
2.2.2.1 Définition
La rhizogenèse désigne la néoformation
et la croissance de racine. Les méristèmes de racines se
répartissent en plusieurs catégories selon leurs origines.
· Les racines latérales se forment de
manière spontanée sur la racine principale dans les conditions
naturelles.
· Les racines adventives sont produites par des
organes divers, soit spontanément, soit accidentellement à la
suite d'une blessure ou d'une manière provoquée, dans les
conditions du bouturage et du marcottage.
· Les racines néoformées, au sein
d'un cal, en culture in-vitro, peuvent être
considérées comme un cas particulier de méristèmes
adventifs (rhizogenèse indirecte) ou l'émission de racines sur un
explant dans des endroits inhabituelles (rhizogenèse directe).
2.2.2.2- Origine des racines
néoformées
La rhizogenèse est un phénomène
complexe, il comporte différentes phases : la
dédifférenciation, formation d'amas de cellules
méristèmatiques , différenciation et organisation des amas
méristèmatiques en primordium racinaire qui se
développeront en jeunes racines ( MARGARA , 1989; BOXUS, 1995).
L'origine des cellules impliquées dans la cicatrisation
dépend de l'espèce. FAVRE (1985) inBOXUS,(1995)sur son
modèle vigne relève que ce sont les cellules du phloème
primaire qui réagissent les premières. Les cellules non
lignifiées d'origine secondaire et le parenchyme cortical, ou même
la moelle peuvent également réagir en formant un tissu
cicatriciel plus ou moins important. Mais dans tous les cas, c'est l'assise
génératrice libéro- ligneuse ( combium) qui donne, des
tissus de bonne aptitude callogène. Le cal est formé
essentiellement de cellules de type méristèmatique secondaire,
qui incorporent certaines cellules voisines parenchymateuses . Les cellules
méristèmatiques se différencient par la suite et
s'organisent pour donner naissance à une nouvelle racine.
2.3-Embryogénèse somatique
2.3.1-Définition
Classiquement, l'embryon est défini comme
étant une plante se trouvant au stade initial de son
développement. Il s'agit en fait d'une structure bipolaire ( munie de
deux méristèmes : l'un caulinaire et l'autre racinaire) qui,
suite au processus de germination, donne naissance à une nouvelle
plante.
Habituellement, l'embryon s'édifie à partir
d'une cellule initiale, le zygote, formé lors de la reproduction
sexuée (embryon zygotique) .
Cependant, d'autres types d' embryons peuvent
également se développer à partir de cellules du sporophyte
ou du gamétophyte, embryons qui ne sont pas le produit d'une fusion
gamétique et qui sont appelés "embryons somatiques" . Parfois,
chez certains espèces, ils résultent d'une embryogenèse
somatique naturelle qualifiée d'apomixie . Dans certains cas en effet,
les anthérozoîdes , l'oosphère , voire d'autres cellules
gamétophytiques peuvent engendrer des embryons
parthénogénétiques. Dans d'autres cas, certaines cellules
sporophytiques localisées au niveau des tissus intra-ovulaire, en
particulier le nucelle, fournissent naturellement des embryons
apoméiotiques appelés aussi "embryons nucellaires. Ce type
d'embryogenèse est très développé dans la famille
des Rutacées, spécialement chez les Citrus (TISSERAT et
al., 1979;VARDI et al., 1990) Toutefois, cette appellation
est essentiellement appliquée , selon certains auteurs comme PIATTI,
(1988) et MARGARA, (1989), aux embryons obtenus à partir de culture de
tissus in-vitro du sporophyte .
2.3.2 - Origine et développement des
embryons somatiques
Les donnés cytologiques montrent que les embryons
somatiques ont pour origine des cellules particulières; dites
embryogènes. Elles présentent des caractères de cellules
méristèmatiques primaires: petites tailles, cytoplasme dense,
gros noyaux aux nucléoles proéminents et petites vacuoles.
Elles fixent de manière intense les colorants ce qui
les rend aisément repérables en cytologie(JULLIEN, 1991 ;LOISEAU
et al .,1998; VASLENKO et al, 2000).
Selon SHARP et al (1980)in PIATTI
(1988)décrivent deux voies pour l'embryogenèse somatique:
La première dite est l'embryogenèse directe
où les embryons sont initiés à partir de tissus en absence
de prolifération de cal. Ceci se produit à partir des cellules
pré-embryogéniques déterminées (P.E.D.C) ou les
cellules sont déjà engagées dans un développement
embryogène et ils ont besoins seulement d'être
libérées (PIATTI,1988; ROUGET,1989). Elle semblent
préexister dans les tissus de certains explants comme les embryons
immatures ou les fragments de très jeunes plantes (SAADI, 1991) .
La seconde dite est l'embryogenèse somatique indirecte,
pour la quelle une prolifération cellulaire est requise. Les travaux de
SHARP (1980) et d'EVANS (1981) in PIATTI(1988) ont également pu
servire à mettre en évidence, l'existence de cellules
initiatrices qui sont déjà différenciées mais
dépourvues de capacité embryogènes. Ils les nomment des
cellules pré-embryogènes indéterminées(PEIC).Les
cellules embryogènes apparaissent tardivement au sein du cal produit par
la réactivation mitotique des cellules différenciées et/
ou la prolifération des cambiums obtenus à partir d'explants de
type racines, tige ou de feuille(JULLIEN,1991 ; RUGKHLA et JONES , 1998)).
Leurs multiplications aboutit à la formation de groupes de cellules
embryogènes "nodules méristèmatiques" dispersés,
parmi les autres cellules du cal et qui sont généralement de type
parenchymateux. A la suite de leur repiquage sur des milieux dépourvus
d'auxines, ces nodules évoluent en des embryons somatiques comme c'est
le cas chez la carotte (SAADI,1991).
Les embryons somatiques connaissent les même stades de
développement morphlogiques que traversent habituellement les embryons
zygotiques à savoir : stade globulaire, cordiforme, torpille et
cotylédonaire(EGERTSDOTTER et ARNOLD , 1998). Ils ont une structure
chromosomique souvent semblable à celle de la plante- mère dont
ils sont issus (NUTI RANCHI, 1995) . Le critère qui permet de
reconnaître un embryon somatique est certainement sa structure
bipolaire, qui développe précocement et simultanément un
méristème caulinaire et un méristème racinaire
(NORREL, 1973 ; NUTI RANCHI , 1990).
2.3.3 Intérêt de l'embryogenèse
somatique
Historiquement , les premiers embryons somatiques ont
été signalés, en 1958, par l'équipe de REINERT
& STUART sur des cultures du parenchyme libérien de racine de
carotte (BELANGER, 1998).Depuis et grâce au progrès
spectaculaire que connaît les techniques de cultures in-vitro,
la production d'embryons somatiques est devenue possible chez un grand nombre
d'espèces végétales.
Comparativement aux autres voies de multiplication
végétative in-vitro , l'embryogenèse somatique se
montre plus séduisante en terme de performance et d'efficacité
(HARKMAN et ARNOLD , 1985 ; PIATTI, 1988). En effet, la maîtrise de
la production d'embryons, chez certaines espèces, via les suspensions
cellulaires permet d'obtenir des milliers d'embryons par litre de milieu de
culture et par conséquent la régénération de
milliers de plants. L'embryogenèse somatique permet aussi en un temps
très court de produire des plantes entières sans passer par les
contraintes que connaît habituellement l'organogenèse ( phase de
caulogenèse et de rhizogenèse) (DAIKH et DEMARLY, 1987 ;
ROGUET, 1989).
La voie de l'embryogenèse somatique est actuellement
intégrée dans de nombreux schémas de sélection
puisqu'elle permet de diminuer sensiblement la longueur des cycles
d'amélioration comme par exemple , le temps nécessaire à
la valorisation du matériel sélectionné âgé
ou juvénile ou la production de parents hybrides nécessaires
à la diffusion de nouvelles variétés (DEMARLY et SIBI,
1989 ; DEMARLY, 1994; STANANTINO et al., 1998; LOISEAU et
al., 1998; TREMBLAY et al., 1999). De telles applications
ont été réalisées chez plusieurs espèces
comme le café (CARNEIRO, 1999) ; la carotte (TOUTE,1998); la luzerne
(REDENBOUGH et al., 1986 FUJII et al., 1987 ; STUART et
al., 1987 ; RAY et BINGHAM, 1989) ;Asparagus officinalis
(MAMIYA et SAKAMOTO , 2001); le palmier dattier (FERRY et al, 1998)
et le palmier à huile (RIVAL et al., 1998).
2.4 Facteurs de la
régénérabilité
Les facteurs influant sur la
régénérabilité in-vitro peuvent être
schématiquement répartis en 2 groupes ( figure 2) . Le premier
représente Les facteurs internes , ( ceux liés à la
plante) et concerne d'une part le génotype , la nature et l'âge
ontogénique de l'explant et d'autre part l'état physiologique de
la plante mère sur laquelle, l'explant a été
prélevé . Le second réunit les différents facteurs
externes qui englobent et les milieux (notamment leur composition en
régulateurs de croissance et les sucres ) et les conditions de
cultures.
2.4.1- Effet de l'explant
Un des atouts majeurs de la culture in-vitro
est de montrer que des cellules somatiques (à 2n chromosomes) ,
pouvaient produire , soit des structures comparables à des embryons
somatiques, soit à des bourgeons et dont le développement permet
de régénérer des plantes conformes à la plante
mère . Pratiquement, n'importent quel organe(bourgeon, racine,
feuille, anthère, etc.) ou fragment d'organe (explant),
prélevé sur celle-ci , peut être cultivé
isolément sur milieu nutritif synthétique, mais le choix de
celui-ci est d'une importance primordiale . On retiendra cependant que la
réponse in-vitro est sous la dépendance de nombreux
facteurs .
· L'age physiologique et ontogénique de
l'organe
Généralement dans les cultures
in-vitro ,on privilégiera les explants les plus jeunes
(embryons immatures , jeunes feuilles , méristèmes etc.) car
c'est l'état juvénile qui semble offrir le plus de
possibilités de régénération ( DAVIS, 1986.,SAADI,
1991). Souvent , ce sont les tissus provenant d'embryons qui expriment le plus
souvent, d'une manière nette et reproductible, l'aptitude à la
régénération, .C'est le cas par exemple du pois (SAADI,
1991); du lupin (DESIRE, 1988) , du coton (BRAR et al. , 1998) ; du
soja (SANTAREM et al ., 1997); du tournesol(CHARNIERE et
al., 1999) ; Pinus sylvestris ( HAGGMAN et al .,
1999) et bien d'autres espèces.
Figure 2 : Les facteurs influants sur l'aptitude à
régénérer in-vitro
· L'époque du
prélèvement
Ce problème se pose surtout pour les espèces
vivaces, on peut distinguer un stade de vie active et un stade de vie ralentie
de la plante ce qui conduit les explants à développer des
réactions différentes en culture in-vitro. Cette
différence peut être expliquée par la modification des
équilibres internes des régulateurs de croissance (auxines,
cytokinines, gibbérelline ...) lors des différentes saisons (AUGE
et al., 1989) .
· La taille de l'explant
Plus la taille est importante et plus les équilibres
endogènes sont déterminants et les conditions extérieures
seront influentes . La taille choisie variera selon la nature de l'explant . si
le tissu végétal est de nature organisée , un ensemble
assez complet sera nécessaire ( soit un noeud , un apex , ou un bourgeon
entier ) mais dans le cas d'une structure différenciée (
éléments de feuilles , de tige, de racines ,inflorescence..) des
fragments de 5à 10 mm suffiront ( ZRYD, 1988., AUGE et al .,
1989; HANNWEG et al ., 1996).
D'une manière générale, il existe
des tissus privilégiés appelés «tissus
cibles » qui répondent à un stimulus indicateur qui
orientera son programme morphogénétique vers une voie
particulière de développement contrairement à certains
tissus récalcitrants aux manipulations in-vitro, dues
essentiellement à un manque de compétence cellulaire(COLEMAN et
ERNST, 1990 ; NUTI RONCHI, 1995 ; YADAV et RAJAM , 1998).
2.4.2-Influence du
génotype
La plupart des plantes montrent une
régénération génotypique spécifique
liée à l'espèce. A l'intérieur d'une même
espèce, un génotype donne des bourgeons tandis qu'un autre ne
peut fournir que des embryons(AUGE et al ., 1989) . Cependant,
plusieurs auteurs mentionnent que seulement certains génotypes
paraissent posséder la capacité d'induire une embryogenèse
somatique . Cette capacité, chez beaucoup d'espèce semble
être génotypiquement contrôlé ( GEORGE et
SHERRINGTON , 1984 ., BROWN, 1988 ; DODEMAN et al ., 1997 ) .
Un tel contrôle de la
régénération ( par la voie de l'embryogenèse
somatique ou de la caulogenèse ) a été rapporté
chez les Légumineuses fourragères est spécialement chez
la luzerne par BROWN et ATANASSOV (1985); Trifolium repens par
PARROT (1991) et bien d'autres espèces . BENCHEIKH et GALLAIS (1996 )
indiquent la présence de quelques gènes majors pouvant
contrôler l'embryogenèse somatique chez le pois. De même
BINGHAM et al (1975) ont réussit à augmenter
considérablement la fréquence embryogène chez
Médicago sativa après deux étapes de
sélection récurrente. REISCH et BINGHAM , (1980) trouvent chez un
génotype de luzerne diploïde que la différenciation de
bourgeons à partir de cal est contrôlée par deux
gènes dominants désignés Rn1 et Rn2 dont la
présence simultanée permet un taux élevé de
régénération ( plus de 75 % des explants) .
L'hétérogénéité existante chez les
Légumineuses fourragères, permet d'expliquer la facilité
à identifier les génotypes favorables à la
régénération .
2.4.3-Influence du milieu de culture
Avec le développement des cultures de tissus , divers
milieux de base comprenant des sels inorganiques , des composés
organiques ( sucres , vitamines et régulateurs de croissances ) ont
été progressivement utilisés .Certains milieux
proposés dans un but donné sont en fait utilisables d'une
manière beaucoup plus étendue.
Les milieux de culture sélectionnés doivent
être le plus parfaitement adaptés aux besoins nutritifs de la
plante soumise à l'étude afin de laisser s'exprimer pleinement
son potentiel génétique.
Les principaux constituants d'un
milieu de culture sont généralement représentés
par les macro et les micro-éléments, une source carbonée
et azotée, des vitamines et des régulateurs de croissance.
Selon EVANS et al , (1981) ,dans 70% des cas , des
milieux de culture de base de type MURASHIGE et SKOOG (MS) ont
été utilisés. Il a été employer d'une
manière générale pour tous les types de cultures
in-vitro . Mais c'est essentiellement pour le déclenchement de
l'organogenèse , en particulier pour la néoformation de
bourgeons que s'est révélé nettement supérieur
à d'autres milieux (MARGARA, 1989) c'est le cas du Cunila
galioides ( FRACARO et ECHEVERRIGARAY , 2001).
Le milieu de MURASHIGE et SKOOG est caractérisé
principalement par une très forte teneur en sels minéraux , en
particulier en potassium et par une concentration également
élevée en azote (60méq/l environ sous forme de nitrate et
d'ammonium ) dont 1/3 apporté sous forme réduite (ionsNH4+); le
rapport nitrate / ammonium, dans ce milieu est très favorable à
l'induction de l'embryogenèse somatique , en particulier chez
Feijoa sellowiana (DEL VESCO et GUERRA , 2001).
Il apparaît à travers la recherche
bibliographique que nous avons effectuées , qu'il existe deux
composantes majeurs du milieu qui peuvent intervenir dans l'orientation du
phénomène de morphogenèse et qui sont
représentées par les régulateurs de croissances et la
source carbonée.
2.4.3.1-Les régulateurs de
croissance
Un régulateur de croissance est défini comme
étant, une substance qui, suivant sa concentration absolue ou relative
dans le milieu, peut supprimer, permettre ou modifier sous certaines conditions
les processus de cytodifférenciations (STREET, 1977).
Aucun régulateur de croissance ne provoque une
initiation directe du phénomène d'organogenèse ou
d'embryogenèse somatique , mais il interfère dans de nombreux
métabolismes internes de la cellule végétale.
l'organogenèse est fortement influencée par les
régulateurs de croissance. Les deux hormones, les plus souvent
utilisés, d'une manière conjointe ou séquentielle, sont
les auxines et les cytokinines. NITSH et NOUGAREDE ,(1967) ont montré
que des explants de parenchyme médullaire de tabac cultivés
in-vitro dans un milieu ne contenant ni auxine ,ni cytokinine ne
prolifèrent pas. Il en était de même lorsque seulement une
auxine ou une cytokinine était incorporée au milieu. Par contre ,
la prolifération cellulaire se déclenchait lorsque ces deux
substances sont présentes dans le même milieu de culture.
Le rapport hormonal (auxine/ cytokinine) conditionne, en
grande partie, le type de néoformation obtenu. Ce rapport a conduit,
dans le cas de la culture in-vitro du parenchyme médullaire de
tabac, par exemple , à l'orientation des tissus, soit vers la
caulogenèse , soit vers la rhizogenèse (SKOOG et MILLER, 1957 in
ZRYD ,1988). Ainsi la néoformation de bourgeons est souvent
favorisée par des teneurs élevées en cytokinine (FRETT,
1977; WALKER et al., 1979; MARGARA , 1989; ABRIE et STADN , 2001;
COMPTON et al., 2001; TANG et GUO, 2001 ) alors que les fortes
doses en auxines stimulent la formation de racines et améliorent leurs
qualités (DRUART, 1992, HOBBIE, 1998; ABRIE et STADN , 2001; COMPTON et
al., 2001).
L'influence de ce rapport hormonal n'est, cependant , pas une
règle générale pour toutes les espèces
végétales . En effet, il suffit, dans certains cas, d'ajouter au
milieu de culture l'un ou l'autre des deux régulateurs
précités pour parvenir à une réponse
morphogénétique (SEON et al. , 1998). Dans ce cas
précis, nous pouvons citer deux exemples : le premier, concerne
le Tritical où l'organogenèse a été obtenue en se
servant uniquement d'auxine ( milieu dépourvu de cytokinine) (VIKRANT
et RASHID , 2001) ; le second, touche l'espèce Piper barberi
gamble où l'équipe d'ANAND et RAO,(2000) a obtenu des
bourgeons néoformés en utilisant des cytokinines seules dans le
milieu d'induction
Par ailleurs ,il est important de dire, en se basant sur la
diversité des réponses obtenues dans ce domaine , qu'il n'existe
pas de règle générale, concernant l'efficacité des
différentes auxines et cytokinines sur la caulogenèse ou sur la
rhizogenèse. Les effets paraissent varier essentiellement avec le
matériel végétal employé.
Tout comme l'organogenèse, Les régulateurs de
croissance de type auxine et cytokinine sont aussi indispensables à
l'embryogenèse somatique.
La production d'embryons somatique est
généralement obtenue en deux phases de culture, sur des milieux
qui différent essentiellement par leurs concentrations en
régulateurs de croissance (AUGE et al., 1989). Par
exemple, chez la carotte ou la luzerne, les embryons sont obtenus en deux
phases: Une phase dite d'induction réalisé sur un
milieu souvent riche en régulateurs de croissance en
particulier en auxines permet la formation et / ou la prolifération
des cellules embryogènes. Ces cellules n'évolueront en embryons
qu'au cours d'une deuxième phase dite de développement
qui se réalise au moyen d'un transfert de tissus induits, sur un nouveau
milieu moins riche , voir dépourvu de régulateurs de croissance
essentiellement en auxines (SAADI, 1991 ; GIORGETTI et al.,1995) .
Cette façon de faire ou plutôt ce schéma
de transfert a été appliqué avec succès dans de
nombreux travaux de recherche portant sur l'obtention de l'embryogenèse
somatique . Nous citons, à titre d'exemple, les travaux
réalisés à partir d'embryons immatures de graminées
(JULLIEN, 1991) , de pois (SAADI, 1991), de coconut (NAIR et al .,
1999) , de Pinus sylvestris ( HAGGMAN et al ., 1999) ,
d'Arabidopsis thaliana ( GAJ, 2001 ) ; de boutons floraux du bananier
(ESCALANT et al., 1994) ; d'hypocotyles du tournesol (LAPARRA et
al., 1997) ; des feuilles du Santalum album et Santalum
spicatum (RUGKHLA et JONES , 1998); etc...
Le transfert des tissus d'un milieu riche en auxine vers un
milieu pauvre n'est pas toujours indispensable pour le déroulement des
différentes phases annoncées précédemment.
L'exemple des travaux de MAHESWAREN et WILIAMS, (1984), portant sur
l'embryogenèse du trèfle et la luzerne, est très
significatif puisqu'ils ont réussi à obtenir, des embryons
somatiques, directement sur les explants d'embryons immatures cultivés
sur un milieu riche en cytokinine et totalement dépourvu d'auxine. C'est
l'exemple aussi des travaux de KRISTEN et al., 2000
réalisés sur les explants de pétioles de Echinecea
purpurea L
Par contre d'autres cultures exigent en phase inductive, la
présence conjointe d'une auxine et d'une cytokinine, c'est le cas de la
luzerne (JULLIEN, 1991); du papayer (MONMARSON et al., 1994); du
cocotier (SERGE, 1998) ; du caféier (CARNEIRO, 1999) et bien
d'autres espèces.
Il est utile de rappeler , que les auxines les plus souvent
utilisées en organogenèse ou en embryogenèse somatique
sont le 2,4-D, l'AIA, l'AIB et l'ANA. A cause de son bon pouvoir inducteur,
le 2,4 -D semble détenir, d'après EVANS et al., 1981, le
record d'utilisation dans les études portant sur l'embryogenèse
somatique (puisque 57 % des travaux de recherche l'utilisent comme
régulateur). Quand aux cytokinines , elles sont
représentées par la Kinétine, , la benzyladenine (BA), la
2- isopentenyladénine et la zéatine.
Outre, les auxines et les cytokinines, d'autres
régulateurs de croissance peuvent intervenir dans le processus
d'organogenèse ou d'embryogenèse somatique tels que les
gibbérellines et l'acide abscissique (ABA) ; cependant, leur
utilisation reste limiter . Les gibbérellines, selon JAYASREE et al,
2001, stimulent fortement la production de bougeons néoformés
chez la pomme de terre lorsqu'elles sont combinées aux cytokinines. Par
contre, d'après MARGARA, 1989, les gibberellines ont la
réputation d'inhiber l'organogenèse et particulièrement la
rhizogenèse chez le Chou-fleur.
L'acide abscissique (ABA) quant à lui, est
employé par certains auteurs dans le but de corriger ou
d'améliorer la qualité morphologique des embryons (UNNIKRISHAN et
al., 1990 ; DODEMAN et al., 1997). Son usage peut inhiber,
en même temps, le déclenchement éventuel d'une
embryogenèse secondaire et empêche la germination précoce
des embryons somatiques MILENA et al., 1998; SVOBODOVA et
al ., 1999).
2.4.3.2-Influence de la source
carbonée
Les tissus en cultures in-vitro sont largement
hétérotrophes via à vis du carbone en raison de l'absence
ou de l'insuffisance de l'assimilation chlorophyllienne. Il est donc
indispensable d'ajouter une source carbonée (des glucides) au milieu de
culture. Les glucides remplissent deux fonctions principales dans les milieux
de culture ; ils fournissent de l'énergie nécessaire pour la
croissance des tissus et maintiennent une pression osmotique donnée du
milieu de culture (ZRYD, 1988). Cette pression osmotique, appelée aussi
« effet osmoticum , peut avoir diverses actions sur les tissus.
Elle agit , dans certains cas , sur l'orientation ou l'expression
morphogénétique des tissus (BELAIZI et BOXUS, 1995; CHARNIERE et
al., 1999), dans d'autres , sur la maturation des embryons somatiques
produits (WALKER et PARROTT, 2001) .
Les glucides, les plus généralement
utilisés sont le saccharose et le glucose (MARGARA,1989; DRUART et
SAMYN,1995). Selon certains auteurs, le maltose peut constituer une bonne
source carbonée puisqu'il permet , dans certains travaux portant sue
l'embryogenèse, d'améliorer à la fois, et la
qualité et la quantité des embryons somatiques produits ( SAADI
, 1991).
L'organogenèse ou l'embryogenèse somatique ne
semblent pas être influencées uniquement par la nature des sucres
mais aussi, et pour un même sucre, par sa concentration dans le milieu de
culture. Généralement, selon PIATTI, 1988, les doses
employées oscillent entre 2 et 12 %.
L'effet dose peut avoir, comme nous l'avons signalé
ultérieurement, une grande influence sur le devenir
morphogénétique des cultures. Dans ce cas , l'exemple du
tournesol est très significatif, l'usage d'une concentration de 12% en
saccharose peut orienter le processus vers la voie de l'embryogenèse
somatique, alors qu'une concentration de 3 % conduirait vers la
néoformation de bourgeons (CHARNIERE,1999).
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