3-TECHNIQUE DE CULTURE IN-VITRO
3.1 Milieux de cultures
Les milieux de culture sont préparés au moment
de l'emploi, à partir de solutions mères concentrées
contenant les macro et micro- éléments et les vitamines de
MURASHIGE et SKOOG (1962) (Annexe N°1).
La source carbonée est assurée par l'apport
seul de saccharose , de glucose , de fructose ou de maltose à une
concentration de 30 g/l. Nous avons employé de l'Agar
«Difco » à raison de 8g/l dans le milieu .
L'auxine, trois régulateurs à effet auxinique
et deux cytokinines ont été testés, employés seuls
ou en mélanges à différentes concentrations. Les
régulateurs de croissances à effet auxiniques utilisées
sont : l'acide naphtylène-acetique (ANA) ; l'acide
indol-3acétique (AIA) ; l'acide 2-4 dichlorophenoxyacetique
(2,4-D). Les cytokinines quant à eux sont représentées
par la 6 benzyl-adenine (BA) et la 6 furfurylaminopurine (Kinetine).
L'identification des milieux de cultures comportant une
auxine, une cytokinine ou les deux combinées est la suivante:
· Les lettres désignent les régulateurs de
croissance utilisés : N pour ANA ; A pour AIA ; D
pour 2,4 D ; B pour BA et K pour Kinétine.
· Les chiffres indiquent la concentration du
régulateur de croissance (en mg/l) additionné au milieu.
L'absence des régulateurs de croissances dans le milieu est
mentionnée par le chiffre 0.
Le pH est ajusté de 5.7 à 5.8 avec une
solution d'hydroxyde de sodium, avant que le milieu ne soit
stérilisé par autoclavage (20 minutes à 120°C ,
2bar). Ils sont ensuite repartis en fraction de 15 ml dans des boites de
pétris stériles de 9 cm de diamètre pour être
utilisé.
3.3-Préparation des explants et ensemencement
Les explants de tiges , de feuilles , de
pétioles et de cotylédons sont plongés dans une solution
d'éthanol à 70 % (V/V) pendant 30 secondes, puis immergés
dans un désinfectant commercial à 12 % (V/V) pendant 15 à
20 minutes . Les explants sont ensuite rincés trois fois à l'eau
distillée stérile afin d'éliminer toute trace du produit
désinfectant. Après la désinfection , les tiges ,
pétioles , feuilles et cotylédons sont découpées
stérilement en fragments d'environ 1 cm de longueur.
A partir de plantules cultivées in
-vitro, âgées de 8 jours ,les explants de
cotylédons , d'apex, d'hypocotyles et de racines sont
prélevés et fragmentées en petits morceaux de 2 mm de
longueurs pour les explants cotylédons, racines et 5 mm pour les
explants hypocotyles .
Les explants ainsi préparés, sont
ensemencés sur les différents milieux , à raison de 15
explants par boites de Pétri avec un nombre de répétition
de cinq(05). Les boites sont ensuite scellées par un film extensible
" parafilm" . La dissection et l'ensemencement se font sous une hotte
stérilisée avec de l'eau de javel et de l'alcool à 70% .
Les pinces et scalpels sont passés à l'éthanol 70% puis
flambés .
3.4 - Conduite des cultures
Après l'ensemencement , les cultures sont
exposées , soit à l'obscurité , soit à la
lumière (2500lux), 16 heurs de photopériode et à une
température de 25 + 1°C. ces dernières conditions
seront maintenues pour la plupart des cultures durant la phase de
développement et de germination des embryons somatiques ou pour
l'enracinement et le développement des bourgeons.
4-EVALUATION DES RESULTATS
4.1-cas de la callogénèse
L'évaluation de la callogénèse a
été appréciée quantitativement (la masse de la
teneur en matière fraîche et sèche ) et qualitativement
(importance, couleur et texture des cals).
La callogenèse est exprimée par le pourcentage
d'explants callogènes pendant une durée d'exposition de quatre
(4) semaines sur le milieu d'induction . En outre la texture, la coloration
sont notée. Ainsi que l'évolution de la matière
fraîche et sèche est suivie au cour du temps. Les cals obtenus
sont prélevés et pesés individuellement. La teneur en
matière sèche est évaluée, après passage
des cals à l'étuve 65°C pendant 24 heurs. La taille (
diamètre) des cals est appréciée approximativement.
4.2 Cas de structures embryogènes ou
organogènes
Le relevé des structures embryogènes ou
organogènes est réalisé périodiquement ce qui
permet de mentionner les observations suivantes:
· Le pourcentage d'explants organogènes ou
embryogènes ( rapport du nombre de cals portant au moins un bourgeon ou
un embryon sur le nombre total des cals examinés).
· Le nombre moyen de structure organogène par
explant organogène ou le nombre moyen de structures embryogènes
par explant embryogène.
· Le rendement correspond au produit entre le
pourcentage de cals organogène ou embryogène et le nombre moyen
de bourgeon ou d'embryon par cal organogène ou embryogène. Ce
dernier paramètre relevé permis de mieux cerné les
potentialités régénératrices des explants et afin
de s'assurer de la nature des structures, une étude histologique est
réalisée.
4.3 Analyse statistique
Les paramètres d'appréciation des
résultats en organogenèse ou embryogenèse somatique
utilisé sont :
1
· La moyenne arithmétique :
^u =
n nXi
i=1
· L'ecart type empirique : ^ =
1
(n-1) n (xi -^)2
i=1
· L'erreur standard : t 1- /2 = ^
(n
1/2 )
Ces paramètres peuvent être définis pour
chacune des boites de pétri ou pour la totalité des boites d'un
même test. L'effet des différents facteurs conditionnant , la
production des structures embryogènes ou organogène est
étudiée statistiquement au moyen des méthodes d'analyse de
la variance (DAGNELIE,1970).Les analyses de la variance sont
réalisées avec le logiciel (statitcf). Pour la comparaison des
moyennes, elle est réalisée à l'aide du test de
NEWMAN& KEULS.
5- ETUDE HISTOLOGIQUE
Les échantillons sur lesquels nous avons
effectué des coupes histologiques sont d'abord fixés pendant 24
heures par le FAA(Formol 40%: 2 ml , Alcool 95%: 17ml , Acide acétique
: 2 ml ) , lavés à l'eau courante pendant 30 minute puis
déshydratés progressivement par des passages successifs dans des
bains d'éthanol de 25% jusqu'à l'alcool absolu pendant 30 minutes
chacun . pour les échantillons de petite taille , une étape
supplémentaire est nécessaire . Elle consiste à les
inclure dans l'agar à 10 % pour pouvoir mieux les orienter .Après
leur passage à l'alcool , les échantillons sont
transférés dans un solvant de la paraffine, le toluène ,
d'abord mélangé à l'alcool ( 3/4 - 1/4 ; 1/2 -1/2 ; 1/4 -
3/4 ) ensuite pur .
Une imprégnation de transition toluène -
paraffine , à l'étuve à 60 °C est effectuée
avant l'inclusion des échantillons dans la paraffine en fusion
coulée, entre deux lames métalliques (barres de LEUKART) et sur
une plaque de verre.
A l'aide de pinces fines et chauffées, les
échantillons sont orientés dans les bains selon le plan de coupe,
avant solidification des blocs. Ceux ci sont sectionnés au mictrome
à 7ou 10 um d'épaisseur selon les échantillons.
En fin les coupes sont montées sur des lames
préalablement gélatinées et après un
déparaffinage au toluène et alcool et un rinçage à
l'eau distillée, elles sont colorées dans le réactif de
SCHIFFS et l'hématoxyline de GROAT. Un passage à l'eau courante
a lieu entre chaque bain de colorant . Les lames sont alors passées
rapidement dans des bains d'alcool 100° absolu et remises à
sécher à 35 °C pendant plusieurs jours.
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