2.2.7Salmonella et
résistance aux antimicrobiens
Salmonella est naturellement sensible à tous
les antibiotiques habituellement efficaces sur les bactéries à
Gram négatif. La résistance aux antibiotiques chez Salmonella est
devenue, ces dernières décennies, matière à
inquiétude pour la santé publique dans le monde (Weill et al.,
2004c). C'est à partir de 1997, que l'OMS signalait l'augmentation
alarmante de l'incidence de souches de Salmonella non typhiques
résistantes aux antibiotiques (WHO, 1997).
En 2002, plusieurs études comparatives de la
résistance aux antibiotiques chez Salmonella non typhiques d'origine
humaine, animale ou environnementale réalisée dans l'UE et
à travers d'autres continents a montré des niveaux de
multi-résistances très inquiétants (Boerlin et Reid-Smith,
2008 ; Cobbold et al., 2006 ; Lauderdale et al., 2006). L'analyse de la
sensibilité aux antimicrobiens des souches humaines du sérotype
Typhimurium a montré des niveaux élevés et stables de
multi-résistance depuis 1993. Il s'est avéré que cette
multi-résistance est due à la présence d'un clone
particulier, individualisé grâce à son lysotype DT104. Ce
clone a intégré dans son chromosome, un îlot
génomique de 43 kb, appelé Salmonella Genomic Island 1 (SGI1),
dont une partie porte les différents gènes impliqués dans
la résistance à l'ampicilline (A), blaPSE-1, à la
streptomycine (S) et à la spectinomycine, aadA1, au
chloramphénicole (C), floR, aux sulfamides (Su), sul1, et aux
tétracyclines (T), tetG, d'où son nom de clone
«penta-résistant» ou «ACSSuT» (Cloeckaert et al.,
2007 ; Mulvey et al., 2006 ; Weill, 2009). Il a d'abord émergé au
Royaume-Uni dès 1989 dans le bétail, puis chez les volailles,
moutons, porcs et chevaux et enfin chez l'homme. Il a ensuite
disséminé en Amérique du Nord et dans plusieurs pays
européens (Aarestrup et al., 2007 ; Casin et al., 1999 ; Glynn et al.,
1998 ; Threlfall et al., 2003). Salmonella Enteritidis, sérotype
prédominant chez l'homme jusqu'en 2004 en France, est resté
majoritairement multi-sensible aux antibiotiques sur la période 1993
à 2004, tandis que le sérotype Hadar, souvent retrouvé
dans la filière avicole, présentait des niveaux
élevés de multi-résistance aux antibiotiques (Weill,
2009). Ces dernières années, de plus en plus de sérotypes
de Salmonella ont acquis des résistances diverses à
plusieurs familles d'antibiotiques tels que les beta-lactamines (Weill et al.,
2004), les aminosides, les quinolones (Cloeckaert et Chaslus-Dancla, 2001), les
fluoroquinolones (Walker et al., 2000), les céphalosporines, etc.,
molécules de choix lorsqu'un traitement s'avère nécessaire
lors des infections systémiques à Salmonella (Stevens et
al., 2006 ; Threlfall, 2002 ; Weill, 2009). Depuis 2000, c'est le cas de
Salmonella Kentucky résistante à haut niveau aux
fluoroquinolones, qui a été identifiée chez l'homme en
France, au Danemark, en GrandeBretagne et aux USA. Les patients étaient
le plus souvent de retour d'un voyage au Maghreb. Cette souche appelée
ST198 serait apparue dans les années 90 en Egypte, aurait ensuite acquis
petit à petit tous ses déterminants de multi-résistance
dont la résistance à la ciprofloxacine en 2000. Ensuite elle
semble s'être disséminée rapidement à l'ensemble du
continent africain à partir de 2005, puis au Moyen-Orient et maintenant
en Asie (Le Hello et al., 2011, Guillon et al, 2013). Elle a également
été détectée dans des élevages de volaille :
des poulets en Ethiopie en 2007 (Le Hello et al., 2011), des poules pondeuses
en Algérie en 2009 (Bouzidi et al., 2011), des dindes au Maroc
dès 2006 (Bouchrif et al., 2008) et en Pologne en 2010 (Wasyl et al.,
2012). Devant l'émergence mondiale de cette souche hautement
résistante aux antibiotiques, plusieurs microbiologistes dont Le Hello
et al. (2013).
v antibiotiques les plus utilisés
L'antibiothérapie est une approche très
précieuse, soumise à des règles strictes d'utilisations
dont l'inobservation peut avoir des conséquences très
regrettables :
- pour le patient traité, dont la guérison est
compromise ;
- parcequ'elle est à l'origine de l'acquisition de la
résistance des souches bactériennes.
v Règles
générales du choix des antibiotiques les plus
utilisés
La mise en oeuvre d'un traitement antibiothérapie,
nécessite un certain nombre de règles à suivre :
- le choix de l'antibiotique ;
- la dose en tenant compte d'une éventuelle
toxicité ;
- l'activité de l'antibiotique pendant une durée
suffisante en tenant compte des particularités : âge, sexe,
grossesse, et pathologies associées (Cambauetal., 1997 ;
Duval, 1980)
Au Tchad, il a été constaté, selon les
fiches d'enquêtes, que les antibiotiques des familles suivantes sont les
plus utilisés : Bêta-lactamines (Pénicillines,
Céphalosporines), Aminosides, Chloramphénicols,
Tétracyclines, Macrolides, Sulfamides, Quinolones, Fluoroquinolones et
divers''(Bessimbaye et al., 2021).
CHAPITRE 3 : Techniques moléculaires
deSalmonella et Shigella
A. Caractérisation des iso-enzymes
Analyse des modifications dans la structure de la
protéine (substitution d'acides aminés), qui est elle-même
le reflet de mutations d'ADN au niveau des gènes de structures de ces
protéines par électrophorèses en gel d'amidon ou
d'acrylamide-agarose, électrophorèse en gel de polyacrylamide en
milieu dénaturant ou (SDS-PAGE) constitue une de ces techniques (Begum
et al., 2008). Les études ont porté essentiellement sur les
enzymes (iso-fonctionnels) ou (iso-enzymes) pour lesquels une mutation
n'altère pas la fonction enzymatique mais provoque une variation de
migration électrophorétique. On peut ainsi, pour une souche
donnée, obtenir une combinaison de variants pour l'ensemble des enzymes
étudiés, appelée «Type
Électrophorétique». Particulièrement
étudiées pour les Salmonelles permettant de définir
différents zymotypes (Selander et al., 1986).
B. Caractérisation génotypique
desSalmonella et Shigella
B.1. Profil plasmidique
La détermination du nombre et de la taille des
plasmides nécessite d'extraire l'ADN plasmidique, de les séparer
par électrophorèse en agarose et de les révéler
après coloration au bromure d'éthidium (BET), les profils
plasmidiques ont été utilises dans plusieurs enquêtes afin
d'aider à caractériser des souches de même sérotype
et d'origines divers (Borrego et al.,1992 ; Martinetti , 1990), elle a permis
de subdiviser des lysotypes chez Typhimurium et Enteritidis (Threlfall et al.,
1989 ; Threlfall et al., 1990). D'autres types d'analyses plus précises
peuvent être réalisées comme la détermination du
profil de restriction ; les méthodes employées sont alors
très fortement identiques à celles utilisées pour l'ADN
chromosomique et permettent d'obtenir un profil de restriction plasmidique.
Cette analyse peut être intéressante pour la mise en
évidence de gènes portés sur un plasmide et elle accroit
la discrimination entre les souches et permet de mesurer le degré de
parenté entre de plasmides de taille similaire (Yves Millemaan, 1998).
Toutefois la détermination de profil plasmidique n'apparait pas aussi
intéressante que les autres méthodes de typage comme la lysotypie
quand le nombre de plasmides est réduit (Poppe et al., 1993) et dans le
cas ou les plasmides sont tellement fréquents dans une espèce
qu'ils ne permettent plus de les subdiviser (Threlfall, 1994).
B.2. Étude de l'ADN chromosomique
desSalmonella et Shigella
Les méthodes utilisent schématiquement deux
types de technologie, l'amplification génique ou PCR (Polymérase
Chain Réaction) et la restriction enzymatique, ces deux derniers pouvant
parfois être combinés pour certaines caractérisations
particulières.
B.2.1. Les techniques basées sur la PCR
(Polymérase Chain Réaction)
Les techniques PCR ont l'avantage d'être simples
à mette en oeuvre et de permettre d'obtenir un résultat
très rapidement. Après la phase d'extraction de l'ADN, la PCR est
réalisée, suivie de l'électrophorèse des produits
amplifiés et de la révélation de ces produits par
coloration au bromure d'éthidium (BET), permettent de réaliser
une amplification génomique de certaines séquences d'ADN, c'est
ainsi plusieurs techniques ont été proposés telle :
· La Technique RAPD « Random Amplification
of Polymorphic DNA » C'est une méthode de typage
très utilisée et nécessite une seule amorce choisie au
hasard, formée d'environ une dizaine de nucléotides et
s'hybridant à plusieurs endroits du génome. Les profils des
produits amplifiés ainsi obtenus peuvent être
caractéristiques de la souche et permettent une bonne discrimination au
sein d'un sérotype donné (Hilton et al., 1996). Elle a
été largement utilisée dans la caractérisation et
le diagnostic de l'infection par Salmonella (Tikoo et al., 2001). RAPD a
été décrite comme un procédé simple et
rapide capable d'offrir des empreintes détaillées de la
composition génomique de la bactérie (Welsch & McClelland,
1990), cette technique a prouvé son pouvoir discriminant puissant par
rapport aux techniques phénotypiques pour la caractérisation de
Salmonella Enteritidis de différentes origines (Betancor et al., 2004).
Cependant la reproductibilité et la répétabilité de
la méthode sont passables ce qui ne permet pas de l'utiliser pour un
suivi de souches à long terme. En effet des profils RAPD
différents peuvent résulter de faibles variations portant sur la
concentration des amorces, le nombre et les conditions des cycles
d'amplification, la qualité et la concentration de la Taq
polymérase (Ellsworth et al., 1993 ; Meunie et al., 1993).
· La Technique MLST
(MultilocusSequenceTyping) La technique MLST, développée
en 1998 pour N. meningitidis (Maiden et al., 1998) du fait de la
difficulté de comparer des résultats de MLEE (MultiLocus Enzyme
Electrophoresis) (Caugant, 2002) est une méthode basée sur
l'analyse de la séquence de 7 gènes dits « gènes de
ménage » dont l'expression est indispensable et qui est responsable
du métabolisme de la cellule. Les gènes séquencés
ont la particularité d'être indépendants des gènes
de virulence de l'agent pathogène et de sa résistance aux
antibiotiques. Cette technique est utile pour des études
épidémiologiques descriptives de biosurveillance, mais peut ne
pas être assez discriminante pour des analyses en situation
d'épidémie suite à l'évolution
génétique lente de gènes de ménage (M'aide et a1.,
1998). L'intérêt et l'avantage de cette méthode est qu'elle
est parfaitement reproductible quelque soit le laboratoire et elle permet
l'établissement d'importantes bases de données
répertoriant chaque séquençage (Chan et al., 2001), et
à laquelle des laboratoires du monde entier ont non seulement
accès, mais peuvent également participer en partageant les
séquences des souches qu'ils étudient. Pour salmonella, la base
de données MLST (MLST Database at UoW, University of WARWICK)
(mlst.warwick.ac.uk/mlst) est une des bases qui ont permis la standardisation
de cette technique MLST pour cette bactérie avec sept gènes de
ménages choisies (thrA, purE, sucA, hisDaroC, hemD et dnaN), amorces
pour amplification et séquençage, d'un autre côté
cette base de données offre les moyens de lecture
d'interprétation des différentes séquences ,
détermination de profil allelique , sequencetype et ainsi le complexe
clonal.
· La Technique MLVA (MultilocusVntrAnalysis)
(Variable Numbers Of Tandem Repeats) Les répétitions en
tandem sont constituées par la répétition et dans un
même sens les uns derrière les autres, de motifs d'ADN
répétés, par opposition aux répétitions
« dispersées » dont les unités
répétées sont dispersées dans le génome,
elles sont initialement décrite chez les eucaryotes, les
séquences répétées en tandem (TR) forment des
familles de répétitions souvent distinguées en deux
grandes classes : les microsatellites et les minisatellites (Jeffreys, 1985).
Les séquences répétées, intra ou
inter-géniques sont différenciées par leur taille, de 1
à 9pb pour les microsatellites formés par glissement lors de la
Réplication et plus de 9pb pour les minisatellites formés lors de
la réparation de cassures dans le double brin, d`origine
réplicative (Vergnaud &Pourcel, 2009). Certaines séquences
répétées en tandem présentent un polymorphisme de
répétitions intra- espèce. Ces séquences
polymorphes, qu'elles soient de type micro ou minisatellites, sont
appelées VNTRs pour (Variable Number of Tandem Repeats). Selon les
génomes bactériens elles peuvent représenter de 2 à
10% de l'ensemble des répétitions en tandem (Denoeud&
Vergnaud, 2004). Les VNTRs sont des régions génomiques instables
dont la mutation est médiée par plusieurs facteurs. La
réponse à des stress environnementaux, est une des raisons de
promouvoir cette forme de variabilité. Ces répétitions en
tandem polymorphes sont nécessaires à l'adaptation des
bactéries à leur environnement par action sur la fonction d'une
protéine (variation antigénique, variation de phase, variation
fonctionnelle, interaction avec d'autres bactéries, interaction avec la
cellule cible, régulation de l'expression d'un gène) (Hood et
al., 1996 ; Madoff et al., 1996). Les VNTRs en raison de leur polymorphisme de
longueur résultant de la variation du nombre de motifs ont conduit au
développement des empreintes génétiques permettant
l'identification humaine dans un premier temps (Jeffreys, 1985), et des
bactéries dans un deuxième temps, dont les premiers travaux ont
été effectués sur Haemophilus influenzae en 1997 (Van
Belkum, 1997) et Bacillus anthracis (Jackson, 1997). Depuis 2003, la
méthode de génotypage par MLVA de S. enterica a été
introduite (Lindstedt, 2003 ; Liu, 2003). Les avantages connus de cette
technique sont les suivants : capacité de typage,
reproductibilité, stabilité, concordance
épidémiologique, ainsi que pouvoir de discrimination
élevé en fonction des marqueurs et des sérotypes
étudiés, (Vergnaud &Pourcel, 2009 ; Ramisse et al., 2004 ;
Lindstedt et al., 2003), ce pouvoir discriminant a été
prouvé et vérifié dans plusieurs études
comparatives entre cette technique moléculaire (MLVA) et d'autres telles
que l'électrophorèse en champ pulsé (PFGE) et la lysotypie
(Boxrud et al., 2007 ; Ross &Heuzenroeder, 2009). La technique MLVA
exploite comme source de polymorphisme la variation du nombre de motifs dans
les répétitions en tandem. L'amplification par PCR d'une
collection de loci répétés en tandem, et la mesure de la
taille des fragments amplifiés, permettent d'assigner à une
souche une série de nombres correspondant au nombre d'unités
répétées dans chaque locus (Vergnaud &Pourcel, 2009).
Des schémas MLVA pour certains sérotypes sont déjà
établis pour d'autres ils sont en cours.
B.2.2. Les techniques basées sur la restriction
enzymatique
Ces méthodes consistent à couper l'ADN extrait
et purifié, avec une enzyme de restriction, permettant ainsi de produire
un certain nombre de fragments d'ADN qui seront ensuite séparés
par électrophorèse en gel d'agarose et
révélés par coloration au BET, deux plus importantes et
les plus largement utilisées sont le ribotypage et
l'électrophorèse en champ pulsé ou PFGE (Pulsed Field Gel
Electrophoresis).
· Ribotypage : IL s'est
développé suite à la REA« Restriction Enzyme Analysis
» qui donnait un nombre de fragments trop important pour que les profils
soient facilement interprétables ; génère une empreinte
hautement reproductible et précise qui peut être utilisée
pour classer les bactéries du genre à travers et au-delà
du niveau de l'espèce. Il consiste à transférer les
fragments d'ADN ayant migré sur une membrane de nylon et à
révéler seulement une partie de ces fragments à l'aide
d'une sonde spécifique, une des sondes les plus couramment
utilisées étant la sonde codant pour les ARN ribosomaux 16S et
23S de Escherichia coli ; elle permet donc de révéler les profils
de restriction des gènes codant pour les ARN ribosomaux ou «
ribotypes ». Le ribotypage a été appliqué à
différents sérotypes de Salmonelles et son pouvoir discriminant
est très variable d'un sérotype à un autre ; dans certains
cas, il n'est pas possible de relier le ribotype obtenu à un
sérotype donné (Selander et al., 1990).
· Électrophorèse en Champ
Pulsé ou (PFGE) (Pulsed Field Gel Electrophoresis) Elle utilise
une endonucléase de restriction à faible fréquence de
coupure permettant ainsi de produire un nombre de fragments directement
exploitable pour l'interprétation des profils. Ces fragments d'ADN
doivent alors migrer dans un champ électrique particulier permettant la
migration de fragments de grosse taille de 30 à 2000kb (Schwartz &
Cantor, 1984) par la technique d'électrophorèse dite CHEF
(ClampedHomogenous Electric Field). La révélation des fragments
se fait de façon classique avec le BET. Les enzymes de macrorestriction
utilisées pour le PFGE des Salmonella sont XbaI, BlnI ou SpeI (Murase et
al., 1995). Cette technique a montré, de façon
générale, un très bon pouvoir discriminant pour
Salmonella, mais il existe des variations en fonction du sérotype
étudié. C'est ainsi qu'il existe un bon polymorphisme par PFGE
chez S. Typhimurium après digestion par XbaI alors que la même
enzyme de restriction donne moins de diversité chez S. Enteritidis.
B.2.3. Techniques de caractérisation
moléculaires combinées (PCR-RFLP)
Utilise des techniques d'amplification géniques et de
restriction enzymatique à la fois, dans le cas des Salmonelles, cette
technique à été utilisée pour la
caractérisation du gène de la flagelline, permettant ainsi une
approche moléculaire d'identification des antigènes flagellaire
(H) dans le but de se substituer à la sérotypie ou de
révéler une phase flagellaire antigéniquement non
décelable. Les gènes de flagelline de certains sérotypes
ont été amplifiés puis clivés par des
endonucléases HhaI ou HphI. Des profils de restriction de gène de
flagelline ont été obtenus pour les deux phases flagellaires,
mais la diversité rencontrée dans ces profils ne correspondait
pas de façon précise aux résultats de l'agglutination
flagellaire (Dauga et al., 1998).
PARTIE 2 MATERIEL ET METODES
CHAPITRE .1APPROCHE
METHODOLOGIQUE
Dans ce deuxième chapitre consacré aux
matériel et méthodes utilisés pour traiter du sujet, ont
été présentées successivement la zone
d'étude, l'espèce à étudiér, les techniques
d'échantillonnage, les traitements expérimentaux et les
techniques d'analyse,.
1.1. Cadre de l'étude
Le Centre Hospitalier Universitaire de la Mère et de
l'Enfant où les analyses bactériologiques ont été
réalisées a une superficie de 15000m², il est limité
au Nord par la rue Charles De Gaulle au Sud par le Centre Hospitalier de
Référence Nationale et le Centre National de Transfusion
Sanguine, à l'Est par la Direction Générale de la Police
Nationale et le Marché Central et à l'Ouest par la rue du Canal
Saint Martin. C'est un etablissement à caractère administratif,
doté de la personnalité morale et jouissant de l'autonomie
financière et de gestion. Il est placé sous la tutelle du
Ministère de la Santé Publique. Cet Hôpital a pour mission
de réduire la mortalité maternelle, néonatale et infantile
notamment par :
§ La prévention ;
§ La prestation des soins ;
§ La formation et le perfectionnement du personnel
technique ;
§ La réalisation des analyses et de diagnostic des
maladies ;
§ Les études et recherches relatives aux
problèmes de santé de la Mère et de l'Enfant
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