2.3 Conservation des souches
isolées
Le milieu de conservation est un milieu pauvre qui maintient
les bactéries dans un état de vie ralentie. Le BCC (Bouillon
Coeur Cervelle) avec 15% de glycérol (glycérine) a
été utilisé comme milieu de conservation. Le
glycérol a été utilisé comme huile minérale
pour prévenir la dessiccation de la gélose du bouillon. Les
colonies ont été raclées à l'aide d'un
écouvillon puis introduite dans les tubes contenant le BCC
glycérol . La conservation se fait dans un congélateur à -
86 ° C à l'aide de cryo-tubes dans une cryo-boite.
2.4 Caractérisation
moléculaire de Salmonella
La caractérisation moléculaire des souches de
Salmonella isolées a été faite au laboratoire de biochimie
et immunologie appliquée Ouagadougou Burkina Faso.
La PCR (Polymerase Chain Reaction ou réaction de
polymérase en chaîne) est une technique d'amplification d'ADN
in vitro qui permet d'obtenir un très grand nombre de copies
d'une séquence d'ADN cible.
Chaque cycle de PCR est constitué de trois
étapes : une dénaturation de l'ADN par chauffage pour
séparer les deux brins qui le composent, une hybridation des amorces aux
extrémités de la séquence recherchée, puis une
élongation grâce à l'action d'une ADN polymérase.
2.4.1 Extraction de l'ADN bactérien
Repiquer sur la gélose Mueller Hinton, les souches
confirmées de Salmonella incuber à 37 °C pendant 18
à 24 H.
Prélever environ quatre à cinq colonies bien
isolées de la culture bactérienne et les remettre en suspension
dans 5 ml de Bouillon Coeur Cervelle, pour une culture à 37 °C
pendant 24H.
L'extraction de l'ADN bactérien a été
réalisée par thermolyse (Moyoet al., 2007). A l'aide
d'une pipette Pasteur stérile, quelques colonies (02 à 03) de 18
à 24 heures ont été prélevées et
placées dans un tube Eppendorf contenant 300 ìL d'eau
stérile pour PCR. L'ensemble a été
homogénéisé soigneusement jusqu'à la dissolution
complète. Tous les tubes contenant la suspension bactérienne ont
été placés dans un bain marie bouillant à 100
°C pendant 10 minutes. Après ce temps, les tubes ont
été placés dans un congélateur pendant 5 minutes
pour faire éclater les cellules par choc thermique. Ensuite, ces tubes
ont été centrifugés à 12000 trs/mn. Le surnageant a
été utilisé pour la PCR.
2.4.2. Préparation du
mélange réactionnel
La rep-PCR (repetitivesequencebasedpolymerasechainreaction) a
été réalisé en utilisant l'amorce universel GTG5
(5'-GTGGTGGTGGTGGTG-3'). Le volume total de mélange réactionnel
était de 25 microlitre composé de 4 micro litre de Master Mix (5
*FIREPolrMaster Mix), 2 microlitres de l'amorce GTG5 de
concentration 10 micro molaire par ml,2 micro litre de Mgcl2 (2,5 Mm), 2
microlitres d'ADN et 15 microlitres d'eau pure (Water free nuclease).
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