2.4.3. Amplification des
extraits d'ADN
L'amplification a été réalisé en
trois étapes en utilisant le thermocycleur de type Mastercycler nexus
gradient (Eppendorf). Le programme PCR décris par Cissé et al
2019, et Kaboré et al (2021) a été utilisé. Il
s'agit d'une première étape de dénaturation initial a
94° C durant 4 mn, suivi d'une deuxième étape de 30 cycle
constituée chacun d'une dénaturation a 95° C c
durant 30s, une hybridation à 45° C durant 60s, une
élongation à 65° C durant 8mn et enfin une troisième
étape d'élongation finale à 65° C durant 16 mn. Les
produits PCR ont été conservé au frais au 4 °C.
2.4.4. Préparation du
gel d'agarose
Le gel d'agarose a été préparé en
dissolvant 1 g d'agarose dans 100ml du tampon Tris Acétate EDTA (TAE) a
0,5X au four microondes (SHARP R65G10) jusqu'à la dissolution
complète de l'agarose. Après refroidissement de la solution
d'agarose,10 micro litre de Bromure d'Etilium (BET) a 10 mg/ml ont
été ajoutés. Le mélange obtenu a été
coulé dans une cuve horizontal contenant un peigne. Après
solidification le peigne a été retiré, et le gel a
été émerger dans une cuve de migration (ENDURO GEL XL).
2.4.5. Electrophorèse de
produit PCR
La migration des amplicons a été faite sous un
champ électrique de 40 volts et 30 mA durant 2 heure. Pour se faire, 10
microlitres de chaque amplicon ont été introduit dans un puits
sur la gélose. Un marqueur de 100 pb a été utilisé
pour la comparaison de la taille de bande dans chaque profil de souche
étudier. Après la migration, le gel a été
visualisé et photographié par le système d'imagerie UVP
PhotoDoc-It Imaging System.
2.4.6. Traitement du gel
Une observation visuelle a l'oeil nu de profil d'empreinte
génétique obtenue par la rep-PCR a été faite pour
le groupage de souches. Les souches présentant les mêmes profils
d'empreinte génétique ont été affilié
à un même groupe (Cissé et al 2019).
2.4.7. Construction de l'arbre
phylogénétique
les données obtenues par les empreintes
génétiques de chaque souche ont été utilisé.
L'affiliation phylogénétique des souches a été
réalisée grâce aux empreintes génétiques
obtenues par rep-PCR . La construction de l'arbre phylogénétique
a été effectuée en effectuant une analyse de
classification hiérarchique par le programme DendroUPGMA en utilisant
l'index de similarité de Jaccard (Jaccard index, Tanimoto) selon
Kaboré et al. (2021). Les profils de bande pour chaque isolat
ont été convertis en matrice binaire, indiquant la
présence ou l'absence d'une bande caractéristique. L'algorithme
UPGMA a été appliqué à la matrice de similitude
avec une valeur supérieure au coefficient de Jaccard (écart-type)
moyen de 88 %. La souche de SalmonellaenteritidisATCC 13076 a
été utilisé comme souche de référence.
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