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Polymorphisme des antigenes plaquettaires humains dans la population tunisienne( Télécharger le fichier original )par Mabrouka LASSOUED Université de Tunis El Manar - Mastère de Génétique et Bio-ressourses 2007 |
UNIVERSITE DE TUNIS EL MANAR FACULTE DES SCIENCES DE TUNIS
MEMOIRE Pour l'obtention du Mastère de Génétique et Bio-ressourses POLYMORPHISME DES ANTIGENES PLAQUETTAIRES HUMAINS DANS LA POPULATION TUNISIENNE Présenté et soutenu publiquement par Melle : LASSOUED Mabrouka Le 31/12/2007 Soutenu devant le Jury : - Mme. Saida BEN ARAB: Président de Jury - Mr. Slema HMIDA: Membre - Mme. Najet MOJAAT: Encadreur - Mr. Aly RAIES: Membre
Centre National de Transfusion Sanguine Je dédie ce mémoire A La mémoire de mon père Mohamed Tu m'étais le père et l'ami conseiller. Que vous trouviez ici le témoignage de mon inaltérable amour et mon profond dévouement pour vos sacrifices, vos encouragements et vos prières qui ont été le meilleur gage de ma réussite. A Ma chère mère : Hania Que ce travail soit le témoignage de ma gratitude pour l'amour et la sollicitude que vous avez su me prodiguer depuis toujours. Que Dieu vous préserve et Vous prête longue vie. A Toute ma famille et tous mes proches Mes frères Abdallah, Lhédi, Hmed, Hmad et Ali. Mes soeurs Fatma, Salha et Zina. Mes chers Akrmi, Amor, Zied, Tarek, Mohamed, Ala, khmaies Dhia, Abdel kader, Rabii, Aziz, Beha et Anas. Mes chères Leila, Maeyoufa, Saida, Houda, Hanen, Abir, Chiraz et Safa. Merci à mes parents et à ma famille pour leur soutien et leur confiance indéfectibleçç A Mes chers amis Radhi, Sami, Mourad, Rabeh, Samir, Hichem, Chouaib, Mohamed et Tarek. Mes chères amies Amani, Fatma, Neziha, Wafa, Fatma, Sana, Sameh, Nejwa, Rima, Yemina, Sessia, Abir, Nejet, Soumaya, Gleya et Kawther, Semira et Moufida. Je voudrais exprimer ma profonde reconnaissance à mes directeurs de Mémoire Monsieur Slema HMIDA, Professeur à la FPM & Chef service au CNTS Et Madame Najet MOJAAT, Professeur à la FPM & Chef service au CNTS de m'avoir accueilli au sein de leur équipe de recherche, d'avoir mis à ma disposition les moyens matériels et scientifiques pour réaliser ce travail de master. Vous avez su me guider et conseiller tout au long de ce travail. Merci pour vos conseils, pour votre disponibilité inconditionnelle malgré un emploi du temps toujours chargé et merci pour la confiance que vous m'avez portée. Bref, en un mot, merci pour votre générosité. Merci au personnel du laboratoire pour l'ambiance agréable sans laquelle aucun travail serein n'est envisageable. Remerciements particuliers à Melle Houda KAABI pour ses coups de mains et pour ses connaissances. A tous ceux qui ont participé à l'avancement de ce travail, et particulièrement Mr Hajjaj. Mes remerciements s'adressent à Mme Saida BEN ARAB, professeur à la FMT en reconnaissance de l'honneur qu'elle m'accorde en acceptant de présider le jury du mémoire. Un grand merci également au professeur Aly RAIES pour l'honneur qu'il m'accorde en acceptant de juger ce travail. Je remercie le Je remercie vivement le professeur et le coordinateur du mastère de génétique et bio ressources à la faculté des sciences de Tunis, Mohamed EL GAZZAH. Liste des matières II LES GLYCOPROTÉINES DE LA MEMBRANE PLAQUETTAIRE 7 II.1 GÉNÉRALITÉS SUR LES GPS 7 II.2 LES GPS MAJEURES DE LA MEMBRANE PLAQUETTAIRE 8 II.3 LES COMPLEXES GLYCOPROTÉIQUES MAJEURS 9 II.3.1 Le complexe GPIIb/IIIa 9 II.3.2 Le complexe GPIb-V-IX (CD 42) 12 II.4 LES COMPLEXES GLYCOPROTÉIQUES MINEURS 16 II.4.1 Complexe Ia-IIa ou á2â1 (analogue à VLA-2) 16 II.4.3 Le complexe GPIc*/IIa/VLA-6 17 III IMMUNOLOGIE PLAQUETTAIRE 20 III.1 DÉFINITION DES ALLO-ANTIGÈNES PLAQUETTAIRES 20 III.2 LES ALLO-ANTIGÈNES COMMUNS AVEC D'AUTRES CELLULES 20 III.3 LES ALLO-ANTIGÈNES SPÉCIFIQUEMENT PLAQUETTAIRES 20 III.3.1 Fréquences alléliques des systèmes HPA-1-5 chez les différentes populations 36 III.3.2 Les allo-antigènes les plus impliqués dans les immunisations inter-humaines 39 III.3.3 Les allo-antigènes les moins fréquemment impliqués dans les immunisations inter-humaines 40 III.4 ÉTUDE DE POLYMORPHISME PLAQUETTAIRE 42 III.4.1 Méthodes de phénotypage sérologique 42 III.4.2 Méthodes de Typage moléculaire 43 II-2. EXTRACTION DE L'ADN GÉNOMIQUE TOTAL 50 II-3. MISE AU POINT DE LA RÉACTION PCR-SSP 52 III. CONTRÔLE DE L'AMPLIFICATION 57 III-1 Électrophorèse sur gel d'agarose (Delpech. M et al. 1999). 57 III-2 Électrophorèse et visualisation des produits d'amplification 58 RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES 92
Liste des figures FIGURE 1. A: ULTRA STRUCTURE PLAQUETTAIRE B : GLYCOPROTÉINES MEMBRANAIRE ET LEUR LIGANDS : 6 FIGURE 2. ASSOCIATION OBSERVÉES POUR LES DIFFÉRENTES SOUS-UNITÉS Á ET Â DES INTÉGRINES. 7 FIGURE 3. LES GPS DE LA MEMBRANE PLAQUETTAIRE (MILLER. 2005). 8 FIGURE 4. STRUCTURE DE L'INTÉGRINE ÁIIBÂ3 (LAURENT. T. 2004). 10 FIGURE 5. LE COMPLEXE GPIB-IX-V 14 FIGURE 6. NOUVELLE VARIANTE DE L'ALLÈLE HPA-1A. 24 FIGURE 7. LES COMPLEXES GLYCOPROTÉIQUES SPÉCIFIQUEMENT PLAQUETTAIRE 41 FIGURE 8: PROFIL ÉLÉCTROPHORÉTIQUE DES AMPLIFICATION DU SYSTÈME HPA-1 EN GEL D'AGAROSE À 1.5%. 63 FIGURE 9: PROFIL ÉLÉCTROPHORÉTIQUE DES AMPLIFICATIONS DES SYSTÈMES HPA-2, HPA-3, HPA-4 ET HPA-5 EN GEL D'AGAROSE À 1.5%. 64 FIGURE 10: REPRÉSENTATION GRAPHIQUE DE LA DISTRIBUTION ALLÉLIQUES DES YSTÈMES HPA-1, -2,- 3,-4 ET-5 DANS L'ÉCHANTILLON ÉTUDIÉE DE LA POPULATION TUNISIENNE 66 FIGURE 11. REPRÉSENTATION GRAPHIQUE DE LA RÉPARTITION DES FRÉQUENCES 67 FIGURE 12. REPRÉSENTATION GRAPHIQUE DE LA RÉPARTITION DES FRÉQUENCES 71 FIGURE 13. REPRÉSENTATION GRAPHIQUE DE LA RÉPARTITION DES FRÉQUENCES 72 FIGURE 14. REPRÉSENTATION GRAPHIQUE DE LA RÉPARTITION DES FRÉQUENCES 73 FIGURE 15: FRÉQUENCE THÉORIQUE DES DESCENDANTS À RISQUE ALLO-IMMUNS EN (%) POUR LES CINQ PREMIERS SYSTÈMES CHEZ LA POPULATION D'ÉTUDE. 76 Liste des Tableaux TABLEAU I : SPÉCIFICITÉ DES GPS PLAQUETTAIRES. 19 TABLEAU II : IDENTIFICATION GÉNOMIQUES ET PROTÉIQUES DES POLYMORPHISMES DES HPAS (KOUTSOGIANNI. P. 2004). 34 TABLEAU III : LES DIFFÉRENTS ANTIGÈNES PLAQUETTAIRES 35 TABLEAU IV FRÉQUENCES ALLÉLIQUES DES HPA-1,-2, -3, -4 ET -5 CHEZ DIFFÉRENTES POPULATIONS (HTTP://WWW.EBI.AC.UK/IPD/): 38 TABLEAU V : LES DIFFÉRENTS COUPLES D'AMORCES UTILISÉS POUR L'AMPLIFICATION SPÉCIFIQUE DES SYSTÈMES HPA -1 À 5 (CAVANAGH. G ET AL., 1997). 55 TABLEAU VI : COMPOSITION D'UN MILIEU RÉACTIONNEL 56 TABLEAU VII : PROGRAMME PCR UTILISÉ : 57 TABLEAU VIII : RÉSULTATS DU GÉNOTYPAGE DES SYSTÈMES HPAS ÉTUDIÉS 65 TABLEAU IX : FRÉQUENCES ALLÉLIQUES DES SYSTÈMES HPA-1, -2, -3, -4 ET 5. 65 TABLEAU X : FRÉQUENCES GÉNOTYPIQUES DES SYSTÈMES HPA-1, -2, -3, -4 ET 5. 66 TABLEAU XI : FRÉQUENCES GÉNOTYPIQUES EN % DES SYSTÈMES HPA-1, -2, -3, -4 ET 5 67 TABLEAU XII : SYSTÈME HPA-3: ÉQUILIBRE DE H-W: ÷2 ET P 69 TABLEAU XIII : SYSTÈME HPA-1 : ÉQUILIBRE DE H-W ; ÷2 CORRIGÉ ET P 69 TABLEAU XIV : SYSTÈME HPA-2: ÉQUILIBRE DE H-W; ÷2 CORRIGÉ ET P 70 TABLEAU XV : SYSTÈME HPA-5 : ÉQUILIBRE DE H-W ; ÷2 CORRIGÉ ET P 70 TABLEAU XVI : ÉQUILIBRE DE H-W: ÷2 74 TABLEAU XVII LES FRÉQUENCES GÉNOTYPIQUES DES DÉSENDANTS ENTRE DIFFÉRENTES UNIONS PARENTALES. 75 TABLEAU XVIII : FRÉQUENCES DES ALLÈLES HPA-1 À 5 DANS QUELQUES POPULATIONS AFRICAINES 85 TABLEAU XIX FRÉQUENCES ALLÉLIQUES HPA-1 À 5 DANS QUELQUES PAYS EUROPÉENS. 86 TABLEAU XX FRÉQUENCES ALLÉLIQUES DES HPA-1 À 5 DANS QUELQUES POPULATIONS ASIATIQUES : 86 TABLEAU XXI FRÉQUENCES ALLÉLIQUES DES HPA-1 À 5 DANS QUELQUES PAYS AMÉRICAINS. 87 TABLEAU XXII: FRÉQUENCES ALLÉLIQUES DES HPA-1 À 5 CHEZ QUELQUES PAYS DE L'OCÉANIE. 87 LISTE DES ABREVIATIONS ADN : Acide Désoxyribonucléique ADNc : Acide Désoxyribonucléique Complémentaire ARNm: Acide Ribonucléique messager aa: acide amine ASO: Atherosclerosis Obliterans ATP: Adénosine Triphosphate AMI: Acute Myocardial Infarction/ Infarctus de myocarde BET: Bromure d'Ethidium/ Ethiduim Bromide SBS: Syndrome de Bernard et Soulier/ Bernard-Soulier Syndrome CVD: Ischemic Cerebrovascular Disease CNTS: Centre National de Transfusion Sanguine CAD: Coronary Artery Disease CD: Classe de Différenciation/Cluster of Differenciation d'NTPs: désoxyribonucleosde tri-phosphate DO: Densité Optique EDTA: Ethylene Diamine Tetra-acetic Acid ELISA: Enzyme Linked Immunosorbent Assay. FMAIT: Fetomaternal Alloimmune Thrombocytopenia/ Thrombopénie foeto-maternelle allo-immune FvW: Facteur Von Willebrand/Von Willebrand Factor GPs: Glycoprotéines GPI: Glycosylphosphatidylinositol HPA : Human Platelet Antigen/Antigènes Plaquetaires Humain HEL: Human Erythroleukemia HLA : Human Leucocyte Antigen /Antigènes Leucocytaires Humain HGNC: Human Genome Nomenclature Committee. H.W: Hardy-Weinberg ICAP-1: Integrin Cytoplasmic domain-Associated Protein-1 ISBT: International Society of Blood Transfusion ISTH: International Society on Thrombosis and Haemostasis/Société Internationale de Thrombose et Hémostase l'IS: Ischemic Stroke kDa: Kilo Dalton kb: Kilobase LRR: Leucine-Rich Repeat MAIPA: (Monoclonal Antibody-Specific Immobilization of Platelet Antigens) MI : Infractus Myocordique Mr : Masse moléculaire MO : Moelle Osseuse ul : microlitres ng : nanogrames NA: Non Appreciable NAIT : Neonatal Alloimmune Thrombocytopenia/Thrombopénies Néonatale Alloimmune NAION: Nonarteritic Anterior Ischemic Optic Neuropathy PCR-ASA: Polymerase Chain Reaction Allel Specific Amplification PCR: Polymerase Chain Reaction PCR-ASRA: Polymerase Chain Reaction Allele-Specefic Restriction enzyme Analysis PCR-SSCP: Polymerase Chain Reaction Single-Strand Conformation Polymorphism PHFA: Preferential Homoduplex Formation PCR-OLA: Polymerase Chain Reaction Oligonucleotide Ligation Assay PCR-SSP: Polymerase Chain Reaction Sequence-Specefic Primers pb : Paire de base PNC : Platelet Nomenclature Committee/ Comité de Nomenclature des Plaquettes PSI : Plexins, Semaphorins, Integrins PTR : Platelet Transfusion Refractorines/États réfractaires à la transfusion des PLT PLTs : Les plaquettes PCR: Polymerase Chain Reaction PT : Polytransfused PTP : Post-Transfusion Purpura/ Purpura Post -Transfusionnel SCO : Système Canaliculaire Ouvert SNP: Single-Nucleotide Polymorphism. STD: Système Tubulaire Dense. SAS: Statistical Analysis System SAH: Subarachnoid Hemorrhage SCD : Sudden Cardiac Death SLR : Solution de Lyse des globules Rouges SLB: Solution de Lyse des globules Blanc trs/mn: tours/minute VLA: Very Late Activation receptor VNTR : Variable Number of Tandem Repeat/ Variable Nombre de Répétition en Tandem
Les plaquettes (PLTs) sont de petites cellules sanguines anucléées. Elles sont formées et individualisées dans les mégacaryocytes. Elles jouent un rôle primordial dans l'hémostase. Comme toute autre cellule sanguine humaine, les PLTs portent à leur surface leurs propres systèmes alloantigéniques. Ces antigènes sont portés par les GPs plaquettaires majeures de la membrane et sont désignés, selon la nomenclature internationale, sous le terme de «Human Platelet Antigens» (HPAs). Actuellement, 24 allo-antigènes, spécifiquement plaquettaires, sont définis, et sont reconnus par des sérums alloimmuns. Douze de ces allo-antigènes sont groupés dans 6 systèmes bialléliques (HPA-1,-2,-3,-4,-5, et -15) avec des anticorps sériques contre les deux allo-antigènes. Pour les 12 allo-antigènes restants, un seul allo-antigène par système est identifié par méthodes sérologiques avec l'allo-anticorps correspondant. Le polymorphisme moléculaire de ces systèmes est simple. Dans la plupart des cas, il résulte d'une substitution d'un seul nucléotide (SNP) au niveau du gène codant se traduisant par la substitution d'un seul aa au niveau de l'allo-antigène porté par la GP mature exprimée à la surface plaquettaire. Les allo-anticorps anti-HPAs sont impliqués dans trois situations cliniques : les NAIT, le PTP et les PTR. La distribution des HPAs sur les cellules et les organes est plus large qu'on ne pensait initialement. Par conséquent, ils peuvent jouer d'autres rôles à coté de leur rôle dans l'hémostase : dans la transplantation des organes et des tissus, (antigènes mineures d'histocompatibilité) telle que la transplantation de la MO. Ils peuvent de même être impliqués dans la survenue d'accidents cardiovasculaires mortelle. Les antigènes plaquettaires sont codés par des gènes dont l'expression est codominante et la distribution varie pour chaque population ethnique. Ils pourraient ainsi constituer des marqueurs génétiques des populations. Notre présent travail vient compléter les études antérieures touchant au polymorphisme plaquettaire. C'est ainsi que nous nous sommes intéressés à l'étude du polymorphisme moléculaire de cinq premiers systèmes plaquettaires HPA-1, HPA-2, HPA-3, HPA-4 et HPA-5, dans un échantillon de la population tunisienne, afin de : - Définir les fréquences alléliques, génotypiques, phénotypiques et haplotypiques dans la population tunisienne des ces cinq systèmes de groupes plaquettaires cliniquement les plus importants. - De comparer ces fréquences á celles rapportées dans la population tunisienne et dans d'autres populations. - D'évaluer le risque potentiel d'allo-umminisation plaquettaire dans la population tunisienne. I Les plaquettes sanguinesI.1 DéfinitionLes PLTs ou thrombocytes sont les plus petits éléments figurés du sang. Elles ont été découvertes tardivement en 1882 par Bizzozero à cause de leur petite taille puis redécouvertes en 1960s après plusieurs décennies d'oubli (Gaetano. G., 2001; Rozman. P. 2002). Ce sont des fragments cellulaires anucléés. Les PLTs naissent par le phénomène de mégacaryocytopoïèse. Leur durée de vie est courte; elles survivent dans la circulation chez l'homme pendant 7 jours environ. Malgré leur absence de capacité de prolifération et leur durée de vie limitée, ces cellules sont en nombre constant dans le sang et perpétuellement renouvelées avec une dynamique exceptionnelle. |
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